栀子为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实，性味苦寒，多用于治疗热病心烦、火毒疮疡等症。临床上为减弱栀子的苦寒之性，常使用栀子的炮制加工品，如姜栀子、炒栀子、焦栀子与栀子炭。其中焦栀子具有凉血止血的功效，常用于治疗血热吐血、衄血、尿血等症[1]。焦栀子在生产过程中，通常以颜色的变化作为焦栀子炮制终点判断的依据，如《中国药典》年版规定焦栀子炒至表面焦黑色，而江西、河南等地方炮制规范中焦栀子的炮制终点为炒至焦黄色、焦褐色等[2]。目前不同厂家之间焦栀子饮片质量差异较大，其原因除与药材质量本身相关外，还与焦栀子炮制终点的颜色缺少量化标准紧密相关。

近年来，色彩分析仪广泛应用于饮片的外观描述，其优势在于可将饮片的传统外观辨别经验转化为标准化数据，如利用色彩分析仪考察槟榔、藕节、栀子、山楂炮制过程中火候对颜色的影响[3-5]，鉴别不同炮制程度的制何首乌粉末的颜色等[6]；或结合饮片内在成分含量变化，分析饮片外观与成分含量的相关性，如研究发现鸡冠花成分中木犀草素、槲皮素、山柰酚与色值中的a*呈显著正相关[7]，黄连粉末a*值与小檗碱呈极显著正相关且黄连粉末色度与总生物碱显著相关等[8]。

而在栀子炮制过程中，不仅颜色发生变化，同时伴随着化学成分组成与含量的变化。已有研究表明京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、西红花苷-I（藏红花素）、多糖等成分含量随炮制程度加深而降低，而鞣质、西红花酸（藏红花酸）含量随炮制程度加深而增加[9-12]。本实验室前期利用色彩分析与可见-紫光分光光度法，仅发现焦栀子炒制过程饮片的外观颜色与色素总量与总环烯醚萜类成分呈正相关关系，虽然为后续的研究提供了一定的研究线索，但未能明确到具体的化学成分。本实验在前期工作的基础上，将HPLC指纹图谱的整体分析与栀子炒制过程的外观颜色变化相结合，以多元统计学方法对焦栀子的外观颜色变化与内在成分含量变化进行关联性研究，揭示焦栀子颜色变化密切相关的化学成分，为焦栀子饮片生产工艺标准的制定提供科学依据。

仪器与材料

1.1仪器

CGYB滚筒式燃气炒药机，江阴市香山中药机械有限公司；VA色彩分析仪，含CMOS镜头、颜色校准板与Alphasoft14.3数据分析软件，法国ALPHAM.O.S公司；ST20红外测温仪，美国RAYTEK公司；LC-20A高效液相色谱仪，DAD检测器，日本岛津公司；KQ-B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；XSDU分析天平，梅特勒-托利多公司；FAB电子天平，上海精密科学仪器有限公司。

1.2药材与试剂

栀子GardeniaeFructus，购自河北安国市，产地为江西丰城，经中国中医科学院中药研究所张村研究员鉴定为茜草科栀子属植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实。焦栀子GardeniaeFructusPraeparatus，栀子的炮制品，炮制方法以《中国药典》年版为依据，由河北百草康神药业有限公司依法进行中试生产。

西红花苷-I（批号，质量分数99.11%），购自成都曼斯特生物科技有限公司；山栀子苷、栀子苷酸、去乙酰车叶草苷酸甲酯、羟异栀子苷、鸡屎藤次苷甲酯、京尼平-1-O-β-龙胆二糖苷、栀子苷、6″-香豆酰京尼平龙胆二糖苷、西红花苷-II、绿原酸对照品为本实验室自制，经HPLC面积归一化法测定质量分数达98%以上。色谱分析用甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯，实验用水为纯净水，使用前均经微孔滤膜（0.45μm）滤过；提取分离用甲醇等其他试剂均为分析纯。

方法与结果

2.1焦栀子中试样品制备

将炒药机加热至℃时，投入净制后的生栀子10kg，炒至栀子饮片表面呈焦褐色，内部种子团棕褐色时，取出，每隔1min取样1次。焦栀子炒制时间约14min，样品编号为JZZ1～JZZ14，第14分钟样品经饮片厂老药工鉴别为合格焦栀子样品，且炒制终点样品符合《中国药典》年版下各项规定。其中焦栀子0min样品标记为JZZ0（即生栀子）。

2.2焦栀子炒制过程HPLC图谱动态变化规律

2.2.1供试品溶液的制备取焦栀子0min饮片粉末（40目筛）0.5g于锥形瓶中，精密称定，精密加入50%甲醇溶液25mL，称定质量后，超声提取30min，待样品冷却至室温，以50%甲醇溶液补足减失的质量，滤过，取上清液，过0.45μm有机微孔滤膜，供HPLC检测。

2.2.2对照品溶液的制备取山栀子苷、栀子苷酸、去乙酰车叶草苷酸甲酯、羟异栀子苷、鸡屎藤次苷甲酯、绿原酸，京尼平-1-O-β-龙胆二糖苷、栀子苷、6″-香豆酰京尼平龙胆二糖苷适量，50%甲醇溶解，配成混合对照品溶液，分别取西红花苷-I与西红花苷-II50%甲醇制备成相应的对照品溶液，供HPLC图谱化学成分指认研究用。

2.2.3色谱条件PhenomenexLunaC18（2）A色谱柱（mm×4.6mm，5μm）；检测波长、nm；体积流量1.0mL/min；柱温35℃；进样量10μL；流动相为乙腈-0.5%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～10min，6%乙腈；10～18min，6%～12%乙腈；18～25min，12%～17%乙腈；25～35min，17%～20%乙腈；35～45min，20%～27%乙腈；45～65min，27%～32%乙腈；65～70min，32%～36%乙腈；70～72min，36%～55%乙腈；72～77min，55%～%乙腈。在此色谱条件下，nm下检出14个共有色谱峰（I1～I14），nm下检出7个共有色谱峰（C1～C7），可反映焦栀子炒制过程不同样品的HPLC特征图谱的变化情况。

2.2.4精密度考察取同一焦栀子（JZZ0）0min供试品溶液，重复进样6次，依法检测，结果（表1）显示各色谱峰峰面积RSD值均小于3%，表明该方法精密度良好。

2.2.5重复性考察取焦栀子（JZZ0）0min供试品粉末6份，分别按“2.2.1”项下方法制备成供试品溶液，依法进样分析，结果（表1）各色谱峰峰面积的RSD值均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.2.6稳定性考察取同一焦栀子（JZZ0）0min供试品溶液，分别于进样后0、2、4、8、12、16、24h进样，依法检测，结果（表1）共有峰峰面积RSD值均小于3%，表明共有峰成分在24h内稳定性较好。

以上结果均显示，该色谱分析方法稳定可靠，可用于栀子饮片的鉴别分析。

2.2.7对照图谱由于焦栀子炒制过程中成分呈动态变化，为找到能表征焦栀子整个炮制过程的动态变化成分，本实验利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对焦栀子炒制过程样品进行共有峰识别，并生成对照图谱。同时利用相对峰面积定量法，以对照图谱各共有峰峰面积为基准，观测共有峰成分在焦栀子炒制过程样品中的动态变化。本实验共在nm下识别出14个共有峰，nm下识别出7个共有峰。

2.2.8色谱峰指认基于前期实验室栀子的化学成分分离基础[13]，利用实验室自制对照品，在nm与nm下共指认出11个成分。其中nm下，峰I1为山栀子苷，峰I2为栀子苷酸，峰I3为去乙酰车叶草苷酸甲酯，峰I4为羟异栀子苷，峰I5为鸡屎藤次苷甲酯，峰I7为京尼平龙胆二糖苷，峰I8为绿原酸，峰I9为栀子苷，峰I14为6″-香豆酰京尼平龙胆二糖苷；nm下峰C3为西红花苷-I，峰C5为西红花苷-II（图1）。

2.2.9不同炒制样品相对峰面积根据建立的HPLC图谱分析方法，依法对焦栀子不同炒制样品进样分析，根据各样品峰面积测定结果，以“2.2.7”项下生成对照图谱的峰面积为基准值，进行相对峰面积计算，计算结果见表2。

2.2.10焦栀子炒制过程中图谱动态变化分析以生栀子（JZZ0）图谱作为对照，利用相似度评价软件，计算焦栀子炒制过程样品与0min样品的图谱相似性，计算结果见表3。相似度结果显示，nm下图谱变化较小，而nm下图谱变化较为明显，炒制7min后与初始样品图谱发生明显改变，至炮制终点时相似度仅为0.。根据相似度评价结果，选取0min样品与nm下相似度变化较大的时间点7、11、14min样品相对峰面积，观察炒制过程中共有成分的变化规律（图2）。从图2可以看出，焦栀子炮制过程中大多数成分相对峰面积呈下降趋势，其中nm下各成分与峰I4、I6、I11、I12、I14下降较明显；少数成分呈现先上升后下降的变化趋势，如峰I5、I7与C4相对峰面积在炮制1～7min呈上升趋势，7～14min呈下降趋势，峰I13与C7相对峰面积在炮制1～11min呈上升趋势，其中11min时C7相对峰面积较初始相对峰面积增加了近1.7倍，但至炮制终点时其相对峰面积下降至初始相对峰面积的1/2。

通过焦栀子炒制过程各时间图谱发现，nm下tR为50.1、69.4min与nm下tR为36.5min的成分随炮制程度的加深，其成分结构被破坏，至炮制终点时已无法检出。且通过观察图谱发现，JZZ8样品nm下tR为30.12min的成分为焦栀子炒制过程中产生的新成分，且一直存在于该炮制时间点之后的样品中。以上结果表明，焦栀子炒制过程中其内在化学成分呈现动态变化。

2.3颜色测定

2.3.1色彩分析仪色彩分析仪是基于国际照明委员会（CIE）于年提出CIELAB均匀色空间系统理论，用于客观描述样品颜色空间数值的分析仪器。该色彩系统中L*代表明度指数，a*（红-绿轴）、b*（黄-蓝轴）代表色品指数，样品颜色可用总色值（E*ab）表达，公式为E*ab＝(L*2＋a*2＋b*2)1/2。明度差ΔL*＝L*tn－L*t0与色差ΔE*ab＝(ΔL*2＋Δa*2＋Δb*2)1/2（Δa*＝a*tn－at0，Δb*＝b*tn－bt0，tn为炒制时间点）用于表达样品的颜色变化，当ΔL*为负值代表样品颜色明度低、颜色深，为正值则相反；ΔE*ab值越大，代表与对照样品色值相差越大，其值为6～12个色差单位（NBS）时，其色差可被人眼识别。

2.3.2样品色值测定测定样品之前，利用标准比色板对IRIS视觉分析仪进行校正，校正后将各样品粉末（过40目筛）分别压制于载玻片上，压制厚度约为1mm，重复拍照3次。利用Alphasoft14.3软件对所有样品得到的色号进行聚类分析，聚类分析共筛选出3个色号、、，此3种色号所占比例大于90%（图3），根据样品色号的比例与对应的L*、a*、b*值计算样品E*ab值，结果见表4。从图3可以看出，焦栀子炒制1～8min，其颜色主要由色号与色号贡献，其中色号的比例随炒制时间的延长降低，当焦栀子炒制至第10分钟，色号贡献率不足1%，颜色主要由色号贡献，而10min过后，焦栀子粉末中色号贡献率逐渐提升，至炒制终点14min时，色号贡献率近%。

表4结果显示，焦栀子炒制过程中，E*ab值随炒制程度加深逐渐下降，而其中变化较明显为L*与b*值。炒制终点相对炒制初始的ΔL*值与Δa、Δb*最低，为负值，表明样品颜色亮度由明至暗，颜色由红黄偏向蓝绿转变。且炒制过程中焦栀子样品的色差值逐渐增大，10～12min色差值20，表明此过程中样品颜色的变化可被肉眼显著识别，而炒制终点较初始样品ΔE*ab进一步增大，且色差值较12min样品升高约为7个NBS，表明炒制终点的颜色较炒制过程中样品可被显著识别。

2.4焦栀子颜色与成分动态关联分析

2.4.1成分与色值之间相关性分析将nm与nm下共有峰校正后的相对峰面积与焦栀子炒制过程中的相关色值参数E*ab、L*、a*、b*数据，依次输入至SPSS22.0软件进行皮尔逊（Pearson）相关性分析，结果显示与焦栀子总色值E*ab呈高度线性正相关的为焦栀子中I4、I6、I12、I14、C1、C2、C3、C5，显著正相关的成分为I8、I9、I11、C4、C6，呈一般正相关的成分为I3、I7、I10。其中与明度L*变化呈高度线性正相关的成分为I4、I6、I12、I14、C1、C2、C3、C4、C5、C6，显著正相关的成分为I3、I9、I11，一般正相关的成分为I8、I10、I13（表5）。

2.4.2焦栀子炒制过程中化学成分与颜色动态关联分析为进一步对焦栀子炒制样品进行判别分析，得到与颜色变化相关的显著成分变量，首先将焦栀子炒制过程中各个时间点样品的颜色参数输入至SIMCA-P13.0进行聚类分析（图4），根据聚类分析的分组结果，对焦栀子炒制过程中样品的成分进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），从而得到VIP值大于1的重要成分变量。

聚类分析将焦栀子炒制过程中的样品分成了3类，其中炒制时间1～8min归为第1类，9～12min归为第2类，13～14min归为第3类。利用此归类结果，对焦栀子炒制过程样品的共有成分建立PLS-DA模型。模型参数累积贡献率（R2）为0.，与预测优度系数（Q2）为0.69，均大于0.5，表明该模型为优质模型，可以用于变量的预测。通过此模型预测的焦栀子炒制过程中成分的重要变量值（VIP值，图5），得到10个VIP＞1的成分变量，分别为峰C7（1.）、鸡屎藤次苷甲酯（1.）、峰C4（1.）、去乙酰车叶草苷酸甲酯（1.）、西红花苷-II（1.）、羟异栀子苷（1.）、西红花苷-I（1.）、峰C2（1.）、峰C1（1.）与峰C6（1.）。此10种成分为焦栀子炒制过程中与颜色相关，动态变化较明显的成分。

2.5小结

本实验共筛选出与焦栀子炒制过程中总色值高度相关的8个成分，即羟异栀子苷、6″-香豆酰京尼平龙胆二糖苷、西红花苷-I、西红花苷-II及峰I6、I12、C1、C2，此8种成分含量随焦栀子外观颜色加深而降低，其中羟异栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II及峰C1、C2是焦栀子炒制过程中相对峰面积变化较明显的成分。综上，羟异栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II及峰C1、C2是焦栀子炒制过程中与颜色变化高度正相关且含量变化较显著的5个成分。而峰C1、C2在焦栀子中含量较少，较难进行定量研究，建议将羟异栀子苷、西红花苷-I与西红花苷-II作为焦栀子饮片质量控制标准的候选标志物。

讨论

3.1实验数据处理方法的选择

传统的中药鉴别方法中有眼看、鼻闻、口尝、手捻等，而在炮制饮片过程中，多由饮片的外观颜色变化判断炮制是否得当，此过程受人为主观影响，普适性不高。年由CIE组织提出的LAB色度空间理论，可以准确对颜色进行描述，使样品颜色具有量化值，广泛应用于彩色印刷中。近年来，该理论被引入中药领域，用于对传统中药鉴别中颜色相关的经验量化，从而为中药饮片的质量标准提供参考。

本实验基于CIELAB色彩空间理论，利用色彩分析仪对焦栀子炒制过程中颜色变化进行量化。通过对过程样品各色度值的主成分分析，拟合出2个主成分，在此基础上建立聚类分析，聚类分析结果成功将样品分成了3类。而在焦栀子炒制过程中，焦栀子颜色随着炒制程度的加深，逐渐从初始的橙红色过渡至棕黄色，最后至炮制终点的焦黑色，与聚类分析的结果相吻合，说明聚类分析可以准确地区别不同炒制过程的焦栀子样品。

利用聚类分析的分组结果，对焦栀子炒制过程样品中共有化学成分进行PLS-DA分析，从而筛选出焦栀子炮制过程中含量变化明显的成分。在PLS-DA模型中，模型的好坏通常由R2与Q2共同评价，当二者均大于0.5时，该模型被认为是好模型，本实验中R2与Q2均大于0.5，表明该模型可以解释焦栀子炮制过程中成分含量的变化，SIMCA-P13.0模型说明中，VIP值用于解释X与Y值之间相关的重要性，VIP大于1被认为是重要变量，低于0.5被认为是不重要变量，而0.5～1.0被认为是灰色地带，其值的意义取决于数据集的大小。本实验通过主成分分析、聚类分析、PLS-DA分析3种多元数据分析方法，共筛选出10个焦栀子炮制过程中重要成分变量，即鸡屎藤次苷甲酯、去乙酰车叶草苷酸甲酯、羟异栀子苷、西红花苷-II、西红花苷-I、峰C1、C2、C4、C6、C7。

文献表明环烯醚萜类成分与色素类成分分别在、nm下有较强吸收，但nm下基线不平稳，而nm下基线较平稳，且检出峰数目与nm下一致，故本实验选择、nm作为检测波长。

3.2成分与颜色相关性分析

在Pearson相关性分析中，与焦栀子炒制过程中总色值呈高度线性正相关的变量为羟异栀子苷、6″-香豆酰京尼平龙胆二糖苷、西红花苷-I、西红花苷-II及峰I6、I12、C1、C2，此8种成分含量随焦栀子外观颜色加深而降低。其中西红花苷-I与西红花苷-II是类胡萝卜素类成分，其结构骨架中的共轭二重键是构成其颜色的基础，此类成分多不稳定。化学动力学研究发现，在60℃条件下，西红花苷-I的降解速率常数较大，且半衰期仅为76h，在80℃条件下，降解速度进一步加快，在单一成分模拟炮制过程中，西红花苷-I在℃时，降解速度急剧加快，且部分转化其苷元西红花酸，至℃时，含量极低，高于℃时，西红花苷-I与西红花苷-II几乎检测不到[14-16]。而本实验近炒制终点时，物料温度高达℃以上，虽持续时间较短，但西红花苷-I与西红花苷-II相对含量较初始含量显著降低，结合nm下图谱发现色素类成分整体含量在炮制终点下降均较明显，这可能与其发光结构团共轭二重键在高于℃受到破坏有关。而色素类成分除C7外，均与栀子炒制过程中颜色变化高度正相关，故推断此类成分含量的降低是其外观颜色发生显著变化的主要原因。

且本实验室前期研究发现，栀子炒制过程中其鞣质含量与吸附率随炒制程度的加深而升高，这可能为焦栀子炒制后止血作用增强的原因之一[9]。西红花苷类成分在焦栀子炒制过程中含量呈下降趋势，同时还伴随着成分组成的变化，此与炮制后栀子饮片的药性改变密切相关。通过市场调研发现，各企业生产的焦栀子外观颜色与炒制程度存在一定的差异，而焦栀子目前仅将栀子苷含量作为质量标准不足以反映其质量内涵。本实验通过化学计量学结合色彩分析仪发现色素类成分与焦栀子炒制过程中颜色高度相关，且为焦栀子炒制过程中含量变化较明显的成分，建议在完善焦栀子质量标准中，可将此类成分纳入其质量评价体系，为构建栀子不同饮片专属的质量评价标准提供依据，也为焦栀子炮制工艺技术标准的制定奠定基础。

参考文献（略）

来源：张雪，李晓庆，王云，李玲云，戴业佳，王清浩，麻印莲，宋嬿，张玉莲，吕婷婷，张村.焦栀子炒制过程中HPLC图谱变化与外观颜色的动态关联研究[J].中草药,,49(17):-.