重要小贴士《中药大品种科技竞争力研究报告版》全方位、多角度的介绍了中药产业发展态势、政策趋势分析，以及中药大品种培育和科技竞争力评价，深度解析了当下中成药产业发展图景。首次完整发布了中药大品种科技竞争力版各治疗领域、各地区、各类型42个完整的榜单。数据权威、图表丰富，堪为中药研发和大品种培育的“红宝书”！点击阅读原文，即可订购。

来源：《中华中医药学刊》网络首发时间：-10-20

栀子肝毒性及配伍解毒研究进展

罗羽莎,闻俊,周婷婷通讯作者

(第二军医大学药学系药物分析教研室)

药源性肝损伤(druginducedliverinjury,DILI)是指应用临床剂量的药物时机体受药物或其代谢物产生毒性作用或发生过敏性反应所引起的肝损伤?随着中草药的应用越来越广泛,越来越多的中草药被发现具有肝毒性,中草药源性肝损伤(herbinducedliverinjury,HILI)随之被提出?中国作为一个中草药使用大国,HILI事件发生率较高,因此必须对中草药肝毒性的产生机制及预防措施进行深入的研究?

栀子是茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果实,是首批被列入药食同源名单的药材之一,药用具有泻火除烦,清热利湿,凉血解毒,消肿止痛等功效,现代研究表明其具有降糖?抗炎?抗抑郁?抗氧化?保肝利胆等药理作用?栀子的化学成分主要包括环烯醚萜苷类?三萜类?有机酸和挥发油物质,其中主要活性成分为京尼平苷(即栀子苷)及藏红花素?有研究表明

京尼平苷对四氯化碳?α-异硫氰酸萘酯(ANIT)?对乙酰氨基酚等物质造成的肝损伤及酒精性肝损伤具有缓解和保护作用?然而与之相矛盾的是,近三十年来一直有文献报道栀子及其主要活性成分具有一定的肝毒性,更有学者建议将其从《既是食品又是药品的物品名单》中移除,因此有必要对其肝毒性进行深入探讨?本文结合相关综述及近年来的研究,归纳总结了栀子致肝毒性的相关物质基础?肝毒性产生机制以及栀子配伍使用降低肝毒性方面的研究进展,以期为栀子肝毒性的进一步研究及栀子的安全应用提供参考?

栀子化学成分及其代谢产物中被认为具有肝毒性的物质主要包括京尼平苷?京尼平和栀子蓝等,其中京尼平苷为栀子的主要活性成分,京尼平为京尼平苷的Ⅰ相代谢产物,栀子蓝为Ⅱ相代谢产物?图1是根据文献绘制的京尼平苷体内代谢通路图,虚线框中的化合物分别为京尼平苷?京尼平以及栀子蓝?

1.1京尼平苷

栀子中主要活性成分为环烯醚萜苷类,京尼平苷作为其中最主要的活性成分,具有神经保护?抗糖尿病?保肝?抗炎?抗抑郁?心脏保护?抗氧化?免疫调节等广泛的体内外药理活性,但目前大多数研究结果表明京尼平苷是栀子肝毒性的主要物质基础?

杨洪军等用3.08g·kg-1的栀子水提物?1.62g·kg-1的栀子醇提物以及0.28g·kg-1京尼平苷分别对大鼠灌胃3天后,发现三组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,ALT)?天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST)和总胆红素(totalbilirubin,TBIL)水平均显著增高,肝指数增加,肝细胞肿胀坏死,大量炎症细胞浸润,说明京尼平苷是栀子肝毒性的主要物质基础;王清然等用3?10?30g·kg-1低中高三种剂量的栀子水提物给大鼠连续灌胃给药7?14?28天,发现栀子肝毒性随着剂量的增加而增加,且高剂量给药时其肝毒性呈时间依赖性;另有研究表明京尼平苷小剂量短期给药并不会造成肝损伤,但当口服剂量为50mg·kg-1连续给药超过13周时大鼠肝脏将出现病理性改变,而口服剂量超过mg·kg-1时大鼠将在24~48h后出现肝损伤,且京尼平苷的LD50值为.1mg·kg-1;栀子黄色素作为从栀子中提取的天然色素,早期研究发现其具有肝脏毒性,而其肝毒性也被归因于其中含量高达28%的京尼平苷?

京尼平苷的肝毒性与给药途径有关?综合肝脏指数及ALT?AST活性的考量,京尼平苷口服给药肝毒性最大,鼻腔给药肝毒性最小,提示京尼平苷或通过胃肠道代谢转化为具有肝毒性的物质?京尼平苷的肝毒性也与机体的生理病理状态有关,在给药剂量超过mg·kg-1时可对正常大鼠造成肝损伤,而剂量达到60mg·kg-1时即会加重黄疸模型大鼠肝损伤,提示肝功能损伤的患者需慎用栀子或含有栀子药材的复方,在必须使用栀子时应衡量量-效-毒之间的关系?

京尼平苷肝毒性研究已较为成熟,大量研究表明京尼平苷是栀子肝毒性的物质基础,其肝毒性不仅与剂量和给药时间相关,而且与给药途径及机体生理病理状态有关,随着栀子肝毒性研究的不断深入,更多的研究发现,京尼平苷肝毒性与其体内代谢产物关系密切?

1.2京尼平

最早被提出具有肝毒性的京尼平苷体内代谢产物为京尼平?京尼平是京尼平苷在肠道菌群作用下水解而成的苷元,被认为是发挥栀子保肝利胆作用的重要物质之一,然而近些年的一些研究表明较于京尼平苷,京尼平具有更强的肝毒性?

早在年Yamano等研究发现mg·kg-1的京尼平苷灌胃给药可使大鼠血清AST?ALT水平显著上升,但腹腔注射京尼平苷或使用氯霉素处理时其肝毒性即消失,而用80mg·kg-1的京尼平对大鼠腹腔注射所产生的肝毒性与mg·kg-1的京尼平苷灌胃给药相当,提示京尼平为京尼平苷肝毒性的源头;KimBC等将等量京尼平苷及京尼平同人肝癌Hep3B细胞及大鼠肝癌FaO细胞孵育24h后,发现只有京尼平可诱导肝癌细胞凋亡;卫璐戈等将京尼平苷和京尼平给大鼠灌胃及人体肝细胞L-O2细胞给药,比较两者体内外毒性大小,结果表明京尼平较京尼平苷具有更强的肝脏毒性,任艳青等用京尼平苷和京尼平孵育人肝癌HepG2细胞也得出了相同的结论?

通过对比体内外研究结果可发现,关于京尼平苷具有肝毒性的结论大多基于体内实验,而体外实验研究结果表明京尼平苷几乎没有肝毒性,京尼平在体内外实验中都被证明具有肝毒性,由此可以推测京尼平苷的体内肝毒性是其经胃肠道代谢转化成京尼平所产生的,而京尼平能否在肝脏的代谢下产生毒性更强的代谢产物有待进一步研究?

1.3栀子蓝

栀子蓝是京尼平在体内与氨基酸自发结合生成的蓝色络合物,将栀子给大鼠灌胃后发现其肠道?肝脏?肾脏及粪便均变为蓝黑色,该蓝色物质即为栀子蓝?有学者推测栀子蓝可能是京尼平肝毒性的直接物质基础,但进一步的研究证明栀子蓝只能微弱抑制人肝L-O2细胞的增殖,其肝细胞毒性明显低于京尼平,说明栀子蓝并非京尼平肝毒性的直接物质基础,而只是京尼平苷和京尼平的排泄形式?

1.4其他物质

ChuLi等测定了栀子中十种化学成分的毒性,发现除京尼平苷和京尼平外,京尼平龙胆双糖苷和山栀苷也具有一定的肝细胞毒性,但该结论仅基于细胞存活率实验,其肝毒性有待进一步研究验证?在体内代谢方面,有文献报道京尼平可在体内自发地转换成一种二醛中间体(图1),该中间体可与肝内蛋白质赖氨酸侧链的氨基共价结合而产生肝脏毒性,说明该二醛中间体可能是京尼平产生肝毒性的进一步物质基础?另外有学者对京尼平结构进行修饰合成甲基京尼平,以此破坏其半缩醛结构,结果表明甲基京尼平具有和京尼平苷相同的抗抑郁活性,但肝脏毒性明显降低,说明京尼平的半缩醛结构可能是其产生肝毒性的主要基团?

通过文献调研可以发现,目前关于栀子肝毒性的研究主要集中于京尼平苷和京尼平,二者在体内都可产生肝毒性,但只有京尼平具有明显的体外肝毒性,说明京尼平应为栀子产生肝毒性的直接物质基础,且其肝毒性与其在体内生成的二醛中间体有关?京尼平苷需通过体内肠道菌群的作用才能生成具有肝毒性的京尼平,而京尼平可自发生成二醛中间体并与肝内氨基酸结合,提示肠道菌群和京尼平的半缩醛结构改造可能成为降低栀子或京尼平苷体内肝毒性的有效靶点?

中草药致肝损伤的机制主要与其引起肝细胞凋亡失调?脂质过氧化损伤?线粒体损伤?炎症反应?药物代谢酶异常?胆汁淤积等有关,目前认为栀子产生肝毒性的机制主要包括氧化应激损伤?药物代谢酶异常?胆汁酸淤积及共价结合反应等?

2.1氧化应激损伤

有氧代谢使机体处于氧化平衡的状态,当机体内活性氧物质(ReactiveOxygenSpecies,ROS)增多或清除减少时,平衡状态被打破,机体出现氧化应激(OxidativeStress),当累积到一定的程度时会对细胞产生毒性作用从而诱导细胞凋亡,即引起氧化应激损伤?氧化应激诱导细胞凋亡相关的通路主要包括Fas通路?核转录因子(nuclearfactor-κB,NF-κB)通路?P53/MPTP通路以及JNK通路等,表现为乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)水平上升,ROS含量上升,谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量下降等,一些研究表明栀子的肝毒性可能与机体的氧化应激损伤有关?

KimBC等的研究表明,京尼平诱导人肝癌Hep3B细胞和大鼠肝癌FaO细胞凋亡的机制是诱导了NADPH氧化酶依赖性ROS的生成,进而激活SAPK/JNK1/2信号通路?ChuLi等的研究同样表明京尼平和京尼平苷可与NF-κB和MAPK通路中的促炎因子TNFR1受体紧密结合,破坏肝细胞抗氧化防御系统,增加肝细胞炎性损伤,进而导致细胞凋亡甚至坏死?栀子配伍减毒方面的研究也证实其肝毒性与氧化应激有关,复方中的其他成分可降低肝细胞或肝脏氧化应激水平从而降低栀子肝脏毒性?

2.2药物代谢酶异常

药物代谢酶可分为Ⅰ相代谢酶和Ⅱ相代谢酶,Ⅰ相代谢酶主要为CYP酶,Ⅱ相代谢酶主要为结合反应酶,药物Ⅱ相代谢产物常常没有活性和毒性,因此Ⅱ相代谢被称为解毒反应?肝脏是机体中含有药物代谢酶最多的地方,病变肝脏中CYP酶表达量下降,且在肝癌早期肝脏中即出现Ⅰ相代谢酶减少?Ⅱ相代谢酶增多的现象,因此中药肝毒性可能与其导致药物代谢酶异常有关?

周淑娟等发现中小剂量京尼平苷可使CYP3A2酶活性升高,提示该剂量栀子苷具有肝保护作用,而大剂量京尼平苷可抑制CYP3A2酶活性使栀子中的毒性成分代谢减慢,毒性成分蓄积从而使毒性反应明显?胡燕珍等也筛选出CYP2C23基因作为京尼平苷致肝毒性的相关基因?而WeiJ等应用蛋白质组学的方法确定了甘氨酸-N-甲基转移酶和糖原磷酸化酶作为预测栀子致肝脏损伤的早期生物标志物,这可能与栀子导致的代谢酶异常相关?

2.3胆汁酸淤积

胆汁酸与肝功能密切相关,有研究报道京尼平苷(25,50,mg·kg-1)可通过减少胆汁酸生物合成和摄取发挥肝保护作用,而TianJ等检测了京尼平苷(mg·kg-1)给药后大鼠肝脏中胆汁酸的变化,发现京尼平苷可使大鼠肝脏中总胆汁酸的含量增加75%,并且可下调法尼酯X受体(FarnesoidXreceptor,FXR)?小异源二聚体伴侣受体(smallheterodimerpartner,SHR)及胆盐出口泵(bilesaltexportpump,BSEP)等胆汁酸代谢及转运相关基因的表达量,说明高剂量京尼平苷可通过抑制相关受体活性进而抑制胆汁酸的代谢及转运从而导致胆汁酸淤积而引起肝损伤,表明胆汁酸是栀子发挥保肝利胆作用和产生肝毒性的共同的靶点?

2.4共价结合反应

药物可与机体内的蛋白质?核酸及脂质等大分子物质结合而产生毒性?前文已提及,京尼平可自发地转化成一种二醛中间物,该中间产物可与肝蛋白的赖氨酸侧链共价结合而产生肝毒性?此外,YamanoT等发现低浓度京尼平可发生葡萄糖醛酸化反应,进而进入胆汁排泄,而当京尼平浓度过高时葡萄糖醛酸饱和,京尼平与肝内非蛋白巯基化合物结合而产生肝毒性,因而认为肝内非蛋白巯基化合物具有肝保护作用,而京尼平对该物质的消耗证明其对肝脏造成了一定的损伤?

2.5其他机制

组学的应用给栀子肝毒性的机制研究提供了一个新思路?胡燕珍等应用基因组学的方法筛选了CYP2C23?Nrob2?Aldob?Bcl2和Collα1等5个京尼平苷致肝毒性的相关基因,这些标志基因的发现为栀子肝毒性分子机制通路的深入研究提供了重要的线索?而蛋白质组学方面的研究表明,高剂量(mg·kg-1)的京尼平苷通过影响Atf?Jun?Hmga?Irf?Etv等转录因子的转录活性进而产生了肝脏毒性

目前关于栀子肝毒性的机制研究还不够深入,主要集中于氧化应激损伤,围绕药物代谢酶?胆汁淤积等方面的研究较少?由于中药多组分?多靶点的特点,其产生肝毒性的机制可能也存在于多个方面,今后可结合栀子中化学成分的特点,运用现代研究手段对其肝毒性机制进行更深层次的探讨?

栀子作为一味常用的中药,经常与其他药材配伍使用,含有栀子的常用复方有栀子豉汤?茵陈蒿汤?栀子大黄汤?栀子厚朴汤和黄连解毒汤等,合理的配伍不仅可以增强药效,而且可以降低单味药材的毒性,增加用药安全性?

栀子豉汤是栀子和淡豆豉配伍而成的复方,具有清热除烦?宣发预热的功效?淡豆豉为豆科植物黑豆的成熟果实发酵加工品,其主要活性成分为大豆异黄酮,已有研究证实大豆异黄酮具有较好的抗自由基和抑制NF-κB因子激活的活性,整体动物实验表明栀子与淡豆豉配伍后可显著降低ALT?AST?碱性磷酸酶(ALkalinePhosphatase,ALP)?TBIL水平及肝脏系数,血清药理学实验实验表明栀子豉汤给药组HepG2细胞存活率和锰-超氧化物歧化酶(Mn-superoxidedismutase,Mn-SOD)活性增大?ROS和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量减少,说明淡豆豉可降低栀子肝毒性,且该作用与淡豆豉的抗氧化活性有关?除此之外,本课题组的前期研究表明,淡豆豉可降低大鼠体内京尼平苷和京尼平的暴露量,从药代动力学的角度揭示了淡豆豉降低栀子肝毒性的可能机制,结合大豆异黄酮可改变大鼠肠道菌群结构这一研究结果,进一步推测栀子豉汤配伍减毒的机制可能与淡豆豉调整肠道菌群结构有关?

茵陈蒿汤由茵陈蒿?栀子和大黄三味药组成,临床上主要用于治疗湿热黄疸?灌胃给予大鼠栀子和茵陈蒿汤水煎液比较栀子配伍前后肝毒性大小,发现配伍后大鼠血清ALT?ALP和总胆汁酸(totalbileacids,TBA)水平显著降低,肝组织中SOD活性显著上升,肝细胞凋亡指数显著降低,说明茵陈蒿汤配伍可通过减轻栀子对SOD活性的抑制以及抑制栀子引起的肝细胞凋亡从而降低栀子的肝毒性?

黄连解毒汤由黄连?黄柏?黄芩和栀子四味药材组成,具有清热解毒的功效?同时给大鼠灌胃以栀子和黄连解毒汤水煎液,发现黄连解毒汤给药组大鼠的血清AST?ALT?ALP和TBA水平显著低于栀子组,且肝脏SOD及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-PX)活性显著升高,MDA和TNF-α含量显著降低,Bcl-2蛋白表达量上调,而Bax蛋白表达量下调,说明黄连解毒汤中的其他成分可通过提高清除自由基酶的活性,抑制炎症反应拮抗栀子引起的肝细胞损伤从而降低栀子的肝脏毒性?

尽管有些中药复方可以降低栀子的肝毒性,但有些含栀子的复方如栀子厚朴汤同样具有一定的肝毒性?由于氧化应激损伤是公认的中草药源性肝损伤的机制之一,目前关于栀子配伍解毒方面的研究主要局限于此,但中药作为多成分多靶点的物质,其引起肝损伤的机制也可能存在于多个方面,因此对于栀子配伍解毒方面的研究可结合栀子肝毒性机制的研究从多个角度进行更深程度的探讨?

“药以治病,因毒为能”,栀子作为一味传统的保肝利胆药材,其肝毒性看似与其功效相悖,却诠释了这句古语的深刻内涵?有关栀子肝毒性的研究已有近三十年,目前认为其肝毒性的主要物质基础为京尼平苷和京尼平,而机制研究方面主要集中于氧化应激损伤,其他方面的研究如药物代谢酶异常?共价结合反应和胆汁酸淤积等也有报道?栀子与其他药材伍用可减低其肝毒性,目前这方面的报道主要有栀子豉汤?茵陈蒿汤和黄连解毒汤等,但减毒机制还有待进一步阐明?随着科学技术的不断发展,用于研究中药肝毒性的手段越来越多,其物质基础和产生机制的研究将越来越深入,栀子作为一味较有代表性的中药,正确认识其肝毒性并进行深入研究,有助于我国中医药科学发展,对降低我国HILI事件发生率具有重要意义?

版权声明：本文来源于《中华中医药学刊》网络首发时间：-10-20。中药大品种联盟（BBTCML）编校发布。编辑：远志。转载请标注作者及出处。本