摘要

生物制造设施中支原体污染可能会导致产品的损失和清理成本的增加。支原体可以在哺乳动物细胞培养物中存活，仅会对培养物产生细微影响，并且多数可以透过0.2μm过滤器，0.2μm滤器过滤是细胞培养液的主要除菌方法。支原体培养法和支原体指示细胞法是高度敏感的检测方法，但检测周期长达28天，无法用于生物制造过程的实时监测。为了便于支原体污染的实时监测，有必要开发核酸检测。支原体细胞培养法检测支原体的生长或集落形成单位CFU，核酸检测法测定基因拷贝数，这就使如何比较两种方法的灵敏度出现困难。故意将支原体投入生物反应器的实验风险性很高，因此阻止了商业团体进行该研究，该实验目的是探索生产过程中上游污染支原体引起的多参数变化。在这里，我们研究了一次性灌注摇摆式生物反应器系统，内含CHODG44细胞系（用于表达IgG1单克隆抗体）中精氨酸支原体的生存能力。我们通过培养方法检测精氨酸支原体的生长以及精氨酸支原体对哺乳动物细胞健康状态、代谢和增殖的影响。我们将过程参数和正常状态下测量的反应器指标相对比，包括溶解氧，气体混合物和碱性添加物用以维持pH值，以检查参数改变是否可作为潜在的污染指标。我们的工作表明，在将精氨酸支原体引入培养物的不同时间点，精氨酸支原体会影响CHO细胞生长概况，生存力，营养消耗，氧气消耗和废物产生。更为重要的是，精氨酸支原体对CHO细胞污染的影响与CHO细胞的浓度和精氨酸支原体的最高灌注率有关。实时监测生物反应器中溶解氧、pH控制参数、氨和精氨酸的数值可以及时发现CHO细胞培养中存在的支原体污染。

Mollicutes，通常称为支原体，是细菌的一个属，具有检测难度高，并且很难从哺乳动物细胞培养物中去除的特点。支原体是体积最小的，大部分可自我复制的细菌（0.1–0.3μm直径）。这些生物缺乏细胞壁，因此具有多形性，可以透过生物制造中常使用的0.1–0.22μm无菌滤器。支原体可以通过原材料，如细胞培养基组分污染；也可以通过人为操作细胞系过程，如细胞建库和细胞传代时污染。支原体的基因组很小，因此限制了代谢和复制，这就使得支原体通常需要宿主细胞才能存活。一些种类的支原体引起了细胞培养的隐性污染，特别是在基础研究环境中，很难发现其对细胞健康或细胞培养性能的影响。但是，支原体可以以更微妙的方式通过多种潜在机制改变培养物的性能和产品质量，包括：与培养物争夺养分，诱导异常细胞生长，通过侵入或与宿主细胞融合导致细胞病变，并且改变宿主细胞表达谱。

支原体逃避检测和在哺乳动物细胞培养中生长给接受注射治疗的患者带来风险。然而，鲜有记载详细记录商业化生产上游阶段支原体污染的动力学和过程影响。通常当公司发现培养物中污染支原体后，他们会立即取样检测并测试原材料，从而追溯污染的来源，而后处理污染。一些关于支原体污染哺乳动物细胞系的研究在细胞瓶、摇瓶、转瓶和其他细胞培养标准容器中进行，而没有生物反应器的，因为GMP禁止将支原体引入细胞培养设施。生物反应器和培养容器不同，它不仅可检测和控制过程参数，而且可按照规定速率补充新鲜培养基并移除废弃物。因此，生物反应器在商业生产上游操作中是较摇瓶更好的处理模式。而且，上述研究通常在添加血清的培养基中进行，这在商业背景下是不现实的。支原体可以在下游处理过程中杀灭和清除，减少了药物中污染物残留的风险，然而支原体在上游工序中出现污染对培养物性能和品质的影响却所知甚少。

传统方法检测支原体通常需要14-28天，并且操作繁琐。为了便于快速检测，生物制造商选用了核酸检测法和其他快速微生物检测技术。目前，方法可比性和方法验证方面的挑战阻碍了这些方法的使用。在这里，我们对生物反应器条件下CHO细胞在无血清培养基中表达IgG1免疫球蛋白模型中早期和晚期污染精氨酸支原体情况进行研究，来分析精氨酸支原体在可控生物反应器环境中的生长曲线和其对CHO细胞培养物性能及过程参数的影响。我们的研究有助于了解在生物制造过程中哪些环节容易造成支原体污染，以及在生产过程中哪些指标变化标志着出现了支原体污染。同时，本文也确认了在上游生产过程中开发并使用快速支原体检测方法，如核酸检测法NAT的可行性和意义。

2.1种子株的增殖和接种

本实验使用前述重组CHODG44细胞系表达嵌合IgG1模型。冻存细胞原液（2×细胞/ml）复苏后接种到多个装有mlCDOptiCHO（LifeTechnologies;A）细胞培养基并添加8mML-谷氨酰胺（Corning;25--CV）的1L转瓶中。转瓶在37°C和8％CO2条件下以73rpm的转速培养。当活细胞达到≥2×细胞/ml时，补充新鲜培养基使培养基体积增大到2倍。第二天（接种前一天），每个转瓶用新鲜培养基将体积补充至1L。

接种当天，细胞在23°C下g10min离心富集，然后重悬于新鲜的CDOptiCHO培养基（添加8mML-谷氨酰胺和1×大豆水解物（Sigma-Aldrich;C或S））中。根据文献记载，大豆水解物有利于精氨酸支原体在无血清培养基中生长。用于接种的细胞密度经过测量后向每个生物反应器接种同样的体积，使目标细胞密度达到1×细胞/ml。

表1装量1L生物反应器培养参数

2.2摇摆式生物反应器操作

GEReadyToProcessWAVE25摇摆式生物反应器可在双模式下操作，具有2个2L单独使用生物反应器（最大操作量1升）,含有多孔聚乙烯灌注过滤器（CBL10-34）。两个生物反应器设定相同的参数（具体参数见表1）进行了3次为期14-19天的运转。总共是6个生物反应器的运行，但将第3次运行第12天-高作为第9天-低的对照，这个第12天-高作为生物反应器晚期污染的模型，并作为内部对照（表2）。培养参数除了转动速度和转动角度都由UNICORN系统控制软件自动控制。生物反应器以间歇方式运行，直到谷氨酰胺含量≤1mM，在第2天-高和第2天-对照模型中，谷氨酰胺在灌注开始前1天以2mM剂量添加。当细胞密度达到55×个/ml以上，调整细胞密度使其达到20–40×个/ml，这取决于细胞代次和理想细胞密度降低率。

表2生物反应器运行描述

2.3支原体制备及其引入

用于引入生物反应器的精氨酸支原体为45％甘油冻存，室温融化后，在层流罩条件下使用无菌注射器和一次性移液器吸取。支原体储存液和3ml培养基（OptiCHO/L-谷氨酰胺+大豆水解物）混合加热至37°C，使最终在1L生物反应器中接种浓度达到（低峰值）或–（高峰值）CFU/ml。阴性对照添加同样体积的培养基和补充物，用于加入到未污染生物反应器中。注射器与WAVE生物反应器样品口相连接，通过注射器将接种物注入生物反应器，然后断开连接。接种的支原体大约在接种后1-2h才能扩散开，但这并不影响检测，因为支原体倍增时间需要6h或更长。

2.4一次性生物反应器的灌注

如前所述，生物反应器以间歇方式运行，直到谷氨酰胺含量≤1mM，在第2天-高和第2天-对照模型中，谷氨酰胺在灌注开始前1天以2mM剂量添加。基于先前实验的结果（数据未显示），每次运行以1L/天的速率灌注。总的来说，为了保持谷氨酰胺≥0.5mM和葡萄糖≥0.5g/L，当细胞10×细胞/ml时，灌注增加到2L/天；当细胞20×细胞/ml时，灌注增加到3L/天；当细胞40×细胞/ml时，灌注增加到最高速率3.5L/天。新制备培养基瓶在4℃避光保存不超过7天，每天同一时间更换新的灌注液收集瓶。每天留存部分灌注原始支原体样品用于检测和滴度测定。当CHO细胞的活力下降至30%以下时，终止污染物包的灌注。

2.5过程采样

每天早上和晚上（间隔约8小时）从培养物中取样，使用BioProfileFLEX分析仪（Nova生物医学）测量活细胞密度（VCD），pH，谷氨酰胺，葡萄糖，乳酸，谷氨酸和铵。剩余样品分装保存，以备后期检测和分析。用于平板和菌落计数的支原体样品以45％的甘油悬浮，颠倒试管2-3次混匀样品，室温放置10-15min，然后-20℃保存直到稀释和计数。用于滴度测量的样品4℃g5min离心澄清，使用0.22umPVDF滤膜过滤。无细胞样品-20℃冻存便于之后分析。

2.6支原体定量

精氨酸支原体菌株（ATCC，Manassas，VA）使用SP4+精氨酸琼脂和肉汤（HardyDiagnostics）培养。对照和接种后生物反应器过程样品涂平板，进行菌落计数。即通过PBS将样品进行10倍稀释，每个稀释度取ul用于SP4+精氨酸琼脂涂板，每个样品均要做重复，5天后读数。

2.7LC-MS检测氨基酸表型

样品经过离心和0.22um滤器过滤，而后用高氯酸去除蛋白质和特殊物质。将样品与0.4NHClO4以1：1的比例混合，室温g离心5min。处理后样品收集后用于LC-MS分析。

WatersXevoG2Q-ToF（以ESI阳性灵敏度模式运行）与WatersACQUITYUPLCI-Class耦合用于分析。我们使用Intrada氨基酸色谱柱（Imtakt）进行正相层析并分离氨基酸。使用的缓冲液是A：乙腈+0.1％甲酸，B：mM甲酸铵，流速为0.6ml/min，梯度时间为15min和柱温为40°C。氨基酸标准品（安捷伦）用于在QuanLynx软件中生成20–pmol/μL的校准曲线，用于检测样品中氨基酸的浓度。样品运行3次，误差线表示标准偏差。该方法的其他信息可以在之前工作中获得。

2.8使用蛋白ABLI传感器进行滴度测定

在室温下解冻样品，如前所述，在OctetRED96系统（FortéBio）上使用蛋白A浸入式读取BLI传感器进行滴度测定。每个灌注日通过公式计算细胞特异性IgG1产率（Qp，pg·cell-1·day-1）

tf表示在tf时刻生物反应器中收集的总IgG，收集tf和ti之间的灌注液（如果适用），在tf和ti之间（如果适用）调整细胞密度，ti是ti时刻生物反应器中收集的IgG；Cf和Ci代表给定灌注天数最终和初始活细胞数。

3.1CHO细胞培养物生物反应器中精氨酸支原体的生长

两种单独的早期污染模型（第2天-高和第3天-高），以及相应未污染对照进行了实验（第2天-控制和第3天控制）。CHO细胞在生物反应器中生长，密度≥2×细胞/ml，存活率≥92％时，分别接种和CFU/ml的精氨酸支原体，然后灌注。精氨酸支原体连续2天呈指数增长，最高密度达到约CFU/ml维持3-5天，然后呈指数下降持续2-3天。下降3天后，通过平板计数法无法检测到活的支原体。这些增长趋势反映了精氨酸支原体在摇瓶中以相似条件培养时的情况，但在摇瓶中峰值大约只能达到CFU/ml。

高、低密度精氨酸支原体后期污染模型，通过第9天-低和第12天-高进行，分别接种15和CFU/ml的精氨酸支原体。当CHO细胞密度达到9–12×细胞/ml，活率≥90％时，在加入精氨酸支原体前，以2L/天的速率灌注。在第12天-高模式中，收集数据作为对照直到第12天。在第9天-低模式中，将生物反应器切换为实验流动培养模式，以达到在精氨酸支原体加入前目标活细胞密度为10–15×细胞/ml。第9天-低模式中，精氨酸支原体生长3天，平板计数峰值达到约CFU/ml，该状态保持5天，然后在1天内从暴跌至CFU/ml。但接种后10天仍可检测到活的精氨酸支原体存在。有趣的是，支原体低剂量接种（15CFU/ml）在生长阶段迅速增长，可达到与较高密度接种（CFU/ml）同样的峰值（CFU/ml）。基于该生长曲线，我们得出结论：精氨酸支原体污染剂量与支原体在生物反应器中生长曲线没有明显关系，但其生长受限于培养物中营养成分的含量。在第12天-高模式中，精氨酸支原体在第一天接种入CHO培养物时出现轻微减少，表现为滞后阶段，可能由于接种时在灌注阶段冲洗出去。然后它以指数方式增长了2天，接着是平稳阶段，直到运行结束。总体而言，在本次污染模型中，精氨酸支原体在与CHO细胞以摆动生物反应器模式共培养时，表现出相似的生长曲线，这与起始接种密度和CHO细胞的生长状态无关。

图1四种CHO细胞生物反应器培养物中精氨酸支原体生长情况。在第2天-高和第3天-高模式中，当CHOVCD达到2×细胞/ml时，加入精氨酸支原体，然后开始灌注（模拟早期污染情况）。在第9天-低模式中，当CHOVCD达到10×细胞/ml时加入支原体。在第12天-高模式中，经过3次灌流，使CHOVCD达到10–15×细胞/ml（模拟晚期污染情况）

3.2精氨酸支原体污染后CHO细胞的生长和代谢

根据前期摇瓶实验结果，我们发现精氨酸支原体与CHO细胞共培养，会导致CHO细胞生长速率降低和峰值活细胞密度减小（数据未显示）。然而为了更准确了解生长曲线的改变和CHO细胞代谢，需要排除外界因素干扰，应该在更可控的环境中研究CHO细胞。在可控的生物反应器中，CHO细胞可以有足够时间增殖，可捕获整个生长曲线，可与未污染对照对比。然而，支原体在不锈钢或玻璃生物反应器中生长，增加了其他实验再次使用该设施污染支原体的风险。因此，我们使用一次性，灌注式生物反应器维持过程控制，给CHO细胞提供充足的营养，同时移除废物，为生长提供合适环境，同时满足使用后系统处理，使实验室操作简单化。

在第2天-高和第3天-高早期污染模型中，精氨酸支原体引入生物反应器后，初始CHO细胞活力分别在第3.67天和3.21天降至对照运行平均值（88.86％）3个标准偏差以下。相比之下，对于第9天-低和第12天-高的晚期污染模型生物反应器，在精氨酸支原体引入后，生存力的首次下降发生在第5.71天和5.90天。我们的数据表明，生物反应器参数如活细胞密度、生长阶段和灌注速率是衡量支原体引入后细胞活力降低的重要指标。另外，在第12天-高和第9天-低模型中，支原体起始浓度的差异与活力降低的时间无关。

早期污染后CHO细胞的生长曲线持续2天与对照生物反应器保持一致，在经历1-2天平台期后紧接着是4-5天的降低。晚期污染模型中CHO细胞的生长曲线与早期污染相似，但细胞活率的降低是一个渐进的过程。精氨酸支原体引入CHO细胞后生长曲线和对照CHO细胞相比，能维持4天一致。经历2天平台期后，出现活率的降低。基于以上发现，生长曲线的平稳或下降是比测定已经偏离既定培养条件下细胞活率更具指示性的指标。

对照生物反应器和污染生物反应器中葡萄糖和谷氨酰胺的浓度遵循CHO细胞生长曲线的趋势和时间。换句话说，当CHO细胞生长平稳时，葡萄糖和谷氨酰胺浓度开始增加，可能因为这些营养物质在灌注模式中不会被静止阶段的CHO细胞快速消耗。相反，同样，当CHO细胞生长平稳时，乳酸浓度会降低并趋于稳定。

值得注意的是，葡萄糖作为常见皮肤或土壤来源污染菌，如金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌的碳源，会被迅速消耗掉。商业模式中，葡萄糖、pH和DO的迅速降低，经常被视为污染的标志。由于精氨酸支原体不代谢葡萄糖，葡萄糖消耗不会作为精氨酸支原体污染的标志。实验中培养基被污染后，反应器中葡萄糖在4-5天上升到5-6g/L，表明培养基中葡萄糖基本或很少消耗，这是因为培养基中全部代谢从CHO细胞的葡萄糖消耗型转变为精氨酸支原体的非葡萄糖消耗型。

图2存在或者不存在支原体污染时CHO细胞生长曲线（a）第二天-对照（b）第三天-对照（c）第二天-高（d）第三天-高（e）第九天-低（f）第十二天-高。在未受污染（对照）生物反应器中，CHO细胞的生长用绿色曲线显示，CHO细胞的活力用紫色曲线显示。在受污染的生物反应器模型中，支原体活力测量结果用红色显示，CHO细胞活力表示为黑色，CHOVCD数据为蓝色。灰色背景表示生物反应器以灌注方式运行的时间。VCD迅速降低表示手动细胞分流。

图3含和不含精氨酸支原体污染的CHO细胞生物反应器的葡萄糖、谷氨酰胺、铵、谷氨酸和乳酸分布（a）第2天-对照。（b）第3天-对照。（c）第2天-高。（d）第3天-高。（e）第9天-低。（f）第12天-高。红色背景表示精氨酸支原体引入生物反应器的时间。

相比之下，谷氨酰胺浓度稳定在灌注介质浓度一半的水平，表明支原体将谷氨酰胺作为能量来源，生成终产物氨和谷氨酸盐。这条代谢途径早已被研究者熟知。

氨和精氨酸可以作为支原体污染时最实用的代谢指标，当出现精氨酸支原体污染时，培养物中氨水平平稳升高，而精氨酸含量在3-4天内可以降低90%。在过程样品检测中，其中的15种氨基酸我们都可以进行准确测量，只有精氨酸在精氨酸支原体引入生物反应器后呈剧烈减少趋势。氨的主要代谢途径是精氨酸和谷氨酰胺代谢。精氨酸降解是大多数支原体具有的重要代谢过程，该过程包括3个反应，最终形成产物鸟氨酸、ATP、氨和CO2。培养物中含有高浓度的副产物氨，在灌注速率高达3.5CV/天时，仍可达到25-30mM，仅此一项指标，就可造成生物反应器中CHO细胞的死亡，因为氨在2-10mM时，就对哺乳动物细胞具有负面作用。CHO细胞对于低至4mM的氨敏感。患唾液支原体口腔感染的病人中，氨可以作为一种毒力机制。值得注意的是，在第9天-低和第12天-高模式中，起始培养基和灌注培养基中氨和谷氨酰胺浓度高于第2天-高、第2天-对照和第3天-高、第3天-对照模式。这被确认为是大豆水解物来源的变化所致，这似乎导致了支原体引入后指数生长期的延迟和指数生长率的降低。

3.3精氨酸支原体对培养条件和过程控制的影响

商业生产中，关键过程参数会被自动反馈系统实时收集用以过程控制。因此，精氨酸支原体污染后，我们密切







































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