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文章来源：Cytiva思拓凡

作者：ZhangLixiang，Cytiva

YingBi，原能细胞科技集团

导语

干细胞作为一种能够自我更新和分化的细胞类型，已经为世人熟知。自被发现起，干细胞就一直是研究热点。根据《-年中国干细胞医疗行业市场现状与行业前景调研分析报告》，年全球干细胞产业市场规模为亿美元，到年时已增至亿美元。预测到年，全球干细胞市场规模达到亿美元。

作为在再生医学中使用的最常见的干细胞类型，间充质干细胞（MSC）有着巨大的市场价值空间且不断被看好。

如今，MSC是临床试验中最常用的干细胞类型，也是科学文献中研究最多的干细胞类型。

全球范围内其相关的临床试验超过项，中国临床试验注册中心注册的MSC临床试验超过项。这充分说明MSC治疗是世界范围内临床应用研究的热点，而我国在这一领域的发展也势头强劲。

MSC几乎存在于我们体内的所有组织中，但最常见于骨髓、脂肪组织、脐带组织、脐带血和胎盘。除了具有多功能性和分化成多种细胞谱系外，它们还能分泌多种细胞因子和生长因子，从而实现免疫调节，促进损伤愈合和组织再生。

MSC非常适合细胞治疗的临床应用，因为它们具有多种谱系分化潜力。

它们可以在体外或体内分化成不同类型的功能细胞以代替老化或受损细胞。因为MSC的这些特性，其在年新冠肺炎的治疗中也表现出了积极效果，新冠病毒感染诱发机体内严重的炎症反应，炎性细胞因子增加、外周淋巴细胞减少、肺部损伤等，MSC具有免疫调节能力和损伤修复功能，所以具有治疗新冠肺炎的潜能。目前的初步临床结果显示间充质干细胞移植具有安全性和初步的有效性，是治疗新冠肺炎的又一选择，能够为重症患者提供新的治疗工具。

当前，全球干细胞疗法处在技术到产品转化的过度阶段。那么如何在体外进行细胞规模化的高效扩增，是MSC应用中的关键。

传统扩增MSC的主要方式是采用方瓶、细胞工厂等进行2D贴壁培养，一个病人单次需要回输几个亿单位的细胞，那么就需要大量的2D培养容器以及操作人员；对于贴壁类型的细胞培养，如果想要规模化生产，微载体是不错的选择方式，新型的扩增MSC的方式是使用微载体以及波浪式反应器WAVE，可以高效的进行干细胞的扩增，培养过程如下：

一、实验材料

细胞：间充质干细胞

培养方式：微载体Cytodex1贴壁培养

培养基：无血清无外源蛋白成份明确间充质干细胞培养基（由原能细胞科技集团自主开发）

反应器：WAVE25

二、实验步骤

1.

微载体的预处理

1.1微载体处理：Cytodex1使用DPBS泡发3h。

1.2使用DPBS洗涤2次Cytodex1，DPBS浸泡后灭菌（℃，30min）。

1.3Cytodex1冷却沉淀后，弃上清，安全柜内无血清培养基洗涤2次，定容。

2.

WAVE的操作

2.1无菌环境下拆开细胞袋，安装无菌空气滤器等配件。

2.2将微载体培养液及细胞悬浮液依次从细胞袋输液管道输入。

2.3将细胞袋固定在WAVE反应器托盘上，连接空气泵，设定温度37±0.5度、泵压、反应器转速度和角度。

3.

MSC细胞接种及培养过程

3.1按cells/cm2接种新鲜MSC细胞至微载体培养液中（3g/L）），孵育30min-1h（间歇式摇匀）或者孵育过夜，调节转速至细胞不沉降聚集即可。

3.2每隔一天从细胞袋无菌取样口用无菌注射器抽取5ml-10ml培养液进行镜检及支原体、内毒素等安全性质量检测。

3.3培养4-5天，细胞长满。

4.

MSC细胞的收获

4.1培养4-5天后将细胞微载体悬浮液从细胞袋出液管道输出至细胞收集瓶。

4.2弃上清，DPBS洗涤一遍，加入Tryple消化酶，温和摇匀消化10min-15min。静置，待微载体沉降后，吸取细胞悬浮液。DPBS再洗涤2遍，吸取细胞悬浮液。

4.3离心×g，5min。收集细胞，计数。

三、实验结果

1.

细胞生长情况

按0.6×cells/cm2接种新鲜MSC细胞至微载体培养液中（3g/L），4-5天后细胞可以长满Cytodex1，每cm2可以生长2.5×MSC，细胞在Cytodex1上的生长照片如下图1。

图1.微载体培养MSC生长图片

2.

流式细胞仪检测MSC细胞表面标记物

药典对MSC细胞表面标记物的检测要求是：CD73、CD90、CD≥95%；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR≤2%。对上述培养的细胞进行检测，结果显示细胞表面标记物均满足要求并且阳性指标CD73、CD90、CD、CD44≥98%，阴性指标CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR总和≤2%（数据未显示）。

图2.微载体培养MSC流式表型

3.

MSC成脂和成骨分化

对MSC进行成脂和成骨诱导分化，油红O染色后显示成脂效果很好；茜素红S染色显示成骨效果很好。

图3.微载体培养MSC成脂分化

图4.微载体培养MSC成骨分化

四、成本分析

以培养单人次回输细胞量3.2×cells为例，对比新型和传统扩增MSC方式的成本分析，主要从培养阶段的耗材成本和人员成本角度考虑，其中耗材成本如下图5，使用Cytodex1和WAVE的培养方式相较于mmDish能够节约14%，相较于HyperFlask能够节约%的耗材成本。人员成本角度列于表1，使用Cytodex1和WAVE的培养方式可以减少培养批次，从而降低批次间变异性，同时拥有合理的人员成本。

图5.不同培养方式耗材成本分析

表1.不同培养方式人员成本分析及批次数

总结

综上，采用微载体Cytodex1和波浪式反应器WAVE可以高效培养间充质干细胞，能够得到满足药典需求的细胞表面标记物，以及很好的进行成脂和成骨分化，同时具有较低的耗材消耗成本以及最少的批次数，降低批次间的变异性，便于对过程进行监控。

以上实验数据来自于原能细胞科技集团，原能细胞科技集团是创业板上市公司开能健康（）投资创建的企业，开能健康持有原能集团近16%的股份，是单一最大股东。

目前原能集团总部定位在张江科学城核心区，拥有占地面积60亩，建筑面积7万多平方米的原能细胞产业园。集团旗下有三个主要子公司：以细胞治疗为主业的原能医学技术公司、致力于1+N细胞库建设的原能细胞库有限公司、致力于深低温全自动化装备研发与制造的原能细胞低温设备有限公司，三大子公司各自独立发展，相互协同支持。其中原能医学技术公司、原能低温设备公司都是国家高新企业，其双特异性抗体、全自动、深低温无人值守细胞装备产品备受行业瞩目，已技术授权转让给世界知名生物医药企业或获得订单，展示了良好的发展前景。