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听说细胞界有个名叫CHO的高富帅？谁知道他到底为何方神圣？咱今天就来八卦一下这个年身价就超亿美金（没错，是美金哦）的CHO家族的那些事，CHO细胞已经成为需要复杂翻译后修饰的治疗性蛋白生产的主要工具。这主要得益于CHO细胞的以下一些特点：

1）具有和人类似的翻译后修饰；

2）清晰的历史背景和监管机构的认可；

3）较少的分泌性内源蛋白；

4）在无血清及化学限定培养基中快速稳健的悬浮生长；

5）病毒安全性;

6)四十多年来积累的知识和经验。

随着近些年在细胞工程及细胞培养基以及工艺开发方面的显著进展，CHO细胞的表达量获得了非常显著的提高，超过10g/L的流加培养工艺及25g/L的浓缩灌流培养工艺常见于学术期刊和会议报告。

何为CHO？

CHO为中国仓鼠卵巢细胞，该家族于年在Dr.TheodoreT.Puck实验室诞生（家族长者暂且尊称为CHO-ori），在进行超过10个月的体外培养后，细胞并未表现出普通二倍体细胞的Hayflick界限，仍然可以继续分裂生长，细胞形态从最初的成纤维细胞转变成近上皮细胞的形态。其身强体壮，适应力强得以在全球多个实验室开疆拓土，很快就走上了国际化发展的路线。

CHO家族的发展壮大

CHO家族人才济济，当CHO-DG44各处走穴，大把吸金的同时，CHO家族的另一成员CHO-K1，自从和GS-system成功搭档，立刻获得了无数制片人（药厂）的青睐，大片一部接着一部（重磅药物），家族财富迅猛增长。

在CHOK1SV细胞的基础上，利用Meganucleases技术将CHOK1SV细胞中GS的双等位基因完全敲除，于年推出了CHOK1SVGS-KO细胞株。由于内源性的GS基因被完全敲除，大大提高了筛选效率，缩短了稳定细胞株的开发周期（相比CHOK1SV系统缩短了6周），同时提升了最终克隆的稳定性。

Merck（原SAFC）于年通过ECACC获得CHO-K1细胞株，并将其驯化至化学成分限定培养基CDFusion中，然后进行亚克隆建立CHOZNCHOK1细胞系。在此细胞系基础上，通过ZFN（锌指核酸酶）技术敲除GS双等位基因，获得GS缺陷型细胞株CHOZNGS，并于年推向市场。

基于原始的CHO细胞系，年Thompson实验室分离了一株可用于悬浮培养的CHO细胞，并将此细胞命名为CHO-S。

CHO-DXB11在ColumbiaUniversity诞生，因身体上的缺陷（DHFR缺陷）使他反而更受欢迎，加之他在tPA生产上的精彩表演，让CHO家族吸引了众多星探（药厂及研究机构）的目光。

时尚的风向标总是变换太快，很快人们对CHO-DXB11不再感兴趣，因为它不够纯正（DHFR缺陷得不彻底），在这种背景下，CHO-DG44横空出世，而且凭借其纯粹的血统（无DHFR活性），立刻受到大家追捧，成为新一代宠儿。

除了上述在工业界应用较多的细胞系外，还有其他一些CHO细胞系也在应用。

如在欧洲应用比较多的Selexis公司SURECHO-M细胞株，其源于ECACCCHO-K1细胞系，并经驯化后获得，Selexis表达平台同时运用MARs元件来提升筛选效率和目标蛋白表达量，运用CHO-M的多个项目已经推进到临床实验阶段并有一个分子获得批准上市。

Horizon的HD-BIOP1（GSNullCHO-K1）也是源于ECACCCHO-K1细胞系，通过rAAV技术将双等位GS基因敲除，获得GS缺陷型细胞，但由于基因编辑实验过程中部分实验关键材料记录不全而引起监管机构的担心，Horizon试图通过全基因组测序来消除监管机构的担心，但由于基因组数据过于庞大以及现在对整个基因组数据的解读尚需时日，目前为止尚未在欧美国家获得临床实验批准。

CHO家族繁荣昌盛的原因

身强体壮，适应力强，干活卖力且质量高，怪不得大家都放心把活交给它办；口碑如此之好加上出演的大片都大卖特卖（Herceptin,Humira,Avastin,etc.），财富爆表也是合情合理啊~

尽管在研发阶段很多细胞株可以免费（或极低费用）使用，但一旦需要进入商业化（临床实验）阶段，均需要支付商业化生产许可费用。下表列举了部分细胞株的研发及商业化授权费用模式供参考。

一、细菌污染

一、细菌污染

状态：

细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

解决方法：

可在培养液或血清中加Bacteria?Rid（细胞除菌剂）或Paebacl?Rid（杆菌去除剂）。

说明：Bacteria?Rid特别针对耐药细菌污染，有效替换并超越双抗的一款细胞除菌试剂

1.1球菌污染

状态：

球菌呈球形或近似球形，其大小以细胞直径来表示，一般为0.5~1.0μm。由于球菌分裂面的不同，根据繁殖以后的状态，常见球菌污染：肺炎双球菌、链球菌、金黄色葡萄球菌等。

解决方法：

a.发现细胞有球菌污染，弃掉培养基，用pbs清洗3-5遍；

b.然后按1:比例加入Bacteria?Rid试剂，即：边加边摇匀；

c.每天处理一次，Bacteria?Rid连续处理3-5天，即可完全清除球菌污染。

Tips:球菌污染

1.2杆菌污染

状态：

杆菌，呈杆状，革兰氏染色阳性、阴性或可变，以周生鞭毛运动。当细胞出现杆菌污染，会在显微镜下看到一些杆状游动的小虫子。

Tips:杆菌污染

解决方法：

a.发现细胞有杆菌污染，弃掉培养基，用pbs清洗3遍；

b.然后按1:比例加入Paebacl?Rid试剂，即：边加边摇匀；

c.每天处理一次，Paebacl?Rid连续处理3-4天，即可完全清除杆菌污染。

二、真菌污染

状态：

肉眼观察培养基，发现培养基颜色基本无变化，不浑浊，但是培养基中由絮状漂浮物，显微镜下观察，若感染真菌可看到分叉细丝状的结构（不同种类结构不同），若感染霉菌，显微镜下可看到片状的结构，不透明，真菌及霉菌对影响细胞的生长影响不大。

Tips:念珠菌污染

解决方法：

1.对实验室及培养箱进行彻底消毒，推荐使用专门针对细胞培养环境的Zoftic?系列抑菌剂。

2.若细胞非常珍贵，且不易获得，可以对污染的细胞采取如下操作:

PBS轻轻漂洗细胞，重复此操作数次。加入Candida?Rid杀灭真菌，清除细胞中存在的念珠菌污染。

三、支原体感染

状态：

显微镜下很难捕捉，培养液一般不会浑浊，国内血清很多没做支原体阴性检测，而支原体是血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是生长缓慢，直至慢慢死去。

Tips:支原体污染

解决方法：

预防：实验室新购买的血清及培养基需检测是否含有支原体，引进的新品种细胞需做支原体检测（推荐使用MycoTest?Kit支原体检测试剂盒），向培养基中添加PreNocard?Rid-支原体预防剂，预防细胞支原体污染。

补救：将Nocard?Rid支原体去除剂与完全培养液按1:-比例稀释，加入细胞正常培养；根据细胞污染的严重程度，处理3～6次即可完全清除细胞支原体污染问题。

四、黑胶虫污染

状态：

可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍镜下可看见黑色的小虫布朗运动，培养液不浑浊，一般不会太影响，细胞还可以用。常常可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。

Tips:黑胶虫污染（↑仔细看，在动哦）

解决方法：

预防：PreNabact?Rid-黑胶虫预防剂，1:加到细胞培养液中，正常细胞培养，用于预防黑胶虫污染。

补救：Nabact?Rid-黑胶虫去除剂，1:-比例加到培养液中。血清冻融采取逐级冻融等方法。

1、提高细胞操作技巧，禁止交叉使用枪头，在酒精灯火焰5公分距离内操作。

2、定期对细胞培养箱消毒，培养箱水盘中的水也要定期更换，并使用无菌水。

3、进入细胞房之前及在无菌操作台操作细胞实验之前需使用紫外灯照射30min。定期使用ZoFtic?细胞房除菌剂对细胞房空间进行处理。

4、每次开培养箱之前需用酒精消毒双手。

5、用ZoFtic?培养箱除菌剂和ZoFtic?水盘抑菌剂定期对培养箱进行消毒。

6、配制的培养基需验证无菌后方可进行细胞培养。

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