栀子为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实，属常绿灌木，性寒、味苦，具泻火除烦、清热利湿、凉血解毒之功效[1]。历代本草名著对其用途、生态分布、形态、产地均有记载，近代栀子主要分布于我国东部、中部、西南部各省区，且以四川、江西、湖南、浙江等省为主流产区[2]。栀子主要含有环烯醚萜类、色素、胆碱等活性成分，现代药理学研究表明[3]，以栀子苷、绿原酸、西红花苷类等为代表的药用成分具有抗炎、利胆、保肝、调节血脂等作用。栀子不仅是重要的中药资源，也是化工、食品工业的重要原料，其中天然栀子黄色素是我国传统染料，因其着色力强、色泽鲜艳、色调自然柔和、稳定性好、安全性强、无毒副作用成为当前国际上流行的天然食品添加剂，且需求量逐年增大，具有较高的经济价值[4-5]。
当前，研究人员对栀子的化学成分、药理作用等方面有较多的研究[6-8]，而栀子遗传多样性等相关领域的研究略显薄弱，影响栀子种质资源的保护及新品种的选育。栀子在全国范围内栽培面积较大，栽培类型多样，其中以江西、湖南两省种植面积最大，种植推广的栀子品种约有10个[9]。然而，不同产地的同种药材除遗传组成不同外，生长地点的气候、土壤和地形等环境因素也会对药材产生影响[10]。分子生物技术在种质鉴定及道地性鉴别有稳定可靠的优势，近年来，有少量利用ISSR、RAPD、SCoT技术对江西省[11-12]、四川省[13]、河南省[14]等地栀子遗传多样性的研究报道，但未见有针对浙江产栀子相关分子标记研究的报道。本研究利用ISSR和SRAP技术对栀子3个居群（浙南、华中、西南）21个样品的遗传多样性进行研究，为栀子的道地性研究提供依据，以更好的保护、开发及选育现有的种质资源。
1材料
年7—8月，在江西、四川、湖南、福建、贵州、浙江省各采样点（表1）采集生长良好的栀子G.jasminoidesEllis叶片，采集幼嫩的叶片用于DNA提取，一个DNA样品为同一采样地的5株不同植株叶片共同研磨提取所得。栀子样品经浙江省亚热带作物研究所陶正明副研究员鉴定后，置于存有变色硅胶密封袋中干燥保存。样品来源3个居群：浙南（ZN）13个；华中（HZ）4个；西南（XN）4个。
2方法
2.1基因组DNA提取
采用VWI的plantDNAzol试剂进行基因组DNA提取，按组织破碎、DNA沉淀、DNA清洗、DNA溶解去杂步骤，将每个栀子样品逐一提取DNA，核酸蛋白分析仪测定其质量浓度和质量分数，统一稀释至20ng/μL，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后于?20℃保存待用。
2.2引物筛选
分别从50条ISSR引物和88对SRAP引物中筛选出扩增条带清晰、多态性明显的12条ISSR引物和9对SRAP引物，引物序列见表2。
选取最佳退火温度为52℃。其PCR反应体系为25μL体系：12.5μL高效率的2×预混型Taq酶，1μL浓度为10mmol/L的引物，模板DNA含量40～60ng，补水至25μL。ISSR-PCR以及SRAP-PCR的扩增程序为94℃、5min；94℃、30s，52℃、30s，72℃、2min，共35个循环。最后72℃延伸7min，4℃保存。反应产物ISSR和SRAP采用1.2%琼脂糖凝胶电泳，5×TBE缓冲液，V跑胶1h。电泳结束后紫外凝胶成像系统下观察拍摄，并保存。
2.3数据采集与分析
从凝胶成像系统得到电泳谱带中，选取清晰可辨的电泳条带，在同一位点有清晰谱带的记为“1”，缺失的记为“0”，组成0/1矩阵，分别得到ISSR、SRAP和二者混合数据（ISSR＋SRAP）形成的3个遗传数据0/1矩阵。采用PopGen1.32软件计算多态位点百分率（PPB）、等位基因数（numberofalleles，Na）、有效等位基因数（effectivenumberofalleles，Ne）、Nei’s基因多样性指数（genediversity，H）、Shannon’s多态性信息指数（Shannon’sinformationindex，I）、Nei’s基因分化系数（coefficientofgenedifferentiation，Gst）、居群总基因多样性（totalgenediversity，Ht）、居群内基因多样性（genediversitywithprovenances，Hs）、基因流（estimateofgeneflowfromGst，Nm）和Mantel检验地理距离和遗传距离相关性，采用Ntsys软件进行UPGMA和PCoA分析。
3结果与分析
3.1ISSR、SRAP多态性分析
在ISSR研究中，用筛选的12条引物（表2）对21份栀子材料进行扩增，共扩增出条条带，其中多态性条带条，各引物检测到的PPB为44.44%～%，平均为80.00%，其中以UBC和UBC扩增多态性比例最高。在SRAP研究中（表2），筛选出的9对引物扩增结果表明，各引物检测到的PPB为83.33%～%，21个样品共检测到80条特异性条带，其中多态性条带74个，平均PPB为92.50%，且以ME4＋EM4组合的多态性位点最多，有12个。
12条ISSR引物和9对SRAP引物对栀子叶片模板DNA进行了PCR扩增，建立了相应的DNA指纹图谱，ISSR中以引物UBC分辨力最高，SRAP中引物ME4＋EM4扩增条带最清晰（图1），表明ISSR引物和SRAP引物建立的DNA指纹图谱可以清楚区分3个居群栀子药材。
3.2ISSR、SRAP遗传多样性分析
基于分子标记的栀子居群遗传多样性结果如表3、4所示，在ISSR研究中，21个种源总体物种水平的Na为1.，Ne为1.，H为0.，I为0.，PPB为80.00%。将21个种源按分布地分3个居群，各居群的Na变化幅度1.～1.，平均1.；Ne变化幅度1.～1.，平均1.；H变化幅度0.～0.，平均0.；I变化幅度0.～0.，平均0.；PPB变化幅度29.60%～74.40%，平均46.13%，相对于群体而言，小于21个种源间的变异水平；3个居群之间的遗传多样性Ht为0.，种间遗传多样性Hs为0.，基因分化系数Gst为0.，即居群间遗传变异占居群遗传变异的27.62%，72.38%的遗传变异在种内进行；种群间的Nm为1.，证明居群间存在一定的基因流动。在SRAP研究中，3个居群PPB变化幅度42.50%～72.50%，平均57.92%；Gst为0.，即68.11%的遗传变异发生在种内。基于SRAP的各遗传多样性参数与ISSR研究结果类似，为揭示更精细的栀子基因遗传多样性，本研究采用了ISSR＋SRAP数据相结合为基础分析栀子的基因变异。将2种分子标记相结合的分析结果显示，物种水平的Na为1.，Ne为1.，H为0.，I为0.，PPB为84.88%；各居群的Na变化幅度1.～1.，平均1.；Ne变化幅度1.～1.，平均1.；H变化幅度0.～0.，平均0.；I变化幅度0.～0.，平均0.；3个居群之间的遗传多样性Ht为0.，高于种间遗传多样性Hs为0.，基因分化系数Gst为0.，即居群间遗传变异占居群遗传变异的29.48%，70.52%的遗传变异在种内进行，验证了居群间存在一定的基因流动，居群间的Nm为1.（Nm＞1）。
3.3聚类分析
利用分子标记扩增的条带矩阵得到栀子3个居群的Nei’s遗传相似系数及遗传距离（表5）和UPGMA聚类图（图2）。ISSR数据中居群之间的遗传距离为0.～0.5，遗传相似系数为0.～0.，西南居群和华中居群相似系数最大，表明这2个居群的亲缘关系较近，遗传相似程度最高。利用ISSR矩阵数据得到的UPGMA聚类图（图2）显示，在相似系数0.82处，西南居群中的资中种源、武汉种源、德江种源和凯里种源聚在一起，和实际居群一致，其余种源并不能有效聚类，除了在相似系数0.74处，浙南居群中的平阳种、泰顺（百年生）种、泰顺（10年生）种和文成种被聚在一起；类似结果在ISSR＋SRAP聚类图（图2）中显示，在相似系数0.76处，浙南居群中的平阳种、泰顺（百年生）种、泰顺（10年生）种、福鼎种和文成种被聚在一起，其余种源在相似系数0.69处被聚成一类；与实际居群分类最接近的是基于SRAP矩阵数据得到的UPGMA聚类图（图2），在相似系数约0.70处，3个居群21个种源被分为2大类，I类群为浙南居群，II类群为西南居群和华中居群聚成一类；通过对SRAP标记结果进行主坐标分析生成三维图（图3），其结果与UPGMA聚类分析结果一致。
4讨论
PPB能一定程度上反映遗传多样性，本研究筛选的12条ISSR引物和9对SRAP引物对21份不同来源的栀子种质材料进行PCR扩增，共分别扩增
出条和80条条带，多态性条带分别为条和74条，多态性条带百分率分别为80.00%和92.50%，表明栀子个体间存在较大的遗传差异。综合ISSR＋SRAP标记混合数据（表3），3个居群中，浙南居群PPB最高（73.66%），而西南居群其次（40.98%），华中居群最低（37.56%），说明浙南居群遗传多样性变异水平最高，适应环境能力较强，浙南居群PPB值接近何峰等[13]研究巴中、江津、纳溪产区居群的栀子PPB71.86%和韩建萍等[14]研究华中居群湖南、河南产区的栀子PPB73.02%；本研究基于SRAP分子标记的西南居群PPB为58.75%，结果接近雷栗等[12]研究华中居群樟树、丰城、新干居群PPB的55.17%和江西新干居群PPB的59.17%。因此，本研究遗传多样性指数（PPB、H、I）结果表明，21个种源栀子具有丰富的遗传多样性，ISSR标记和SRAP标记均可揭示栀子基因组信息，且从扩增的多态性位点上看，SRAP标记要更优于ISSR标记。
遗传分化是指遗传多样性在居群内和居群间的分布，种群间的遗传分化程度可根据遗传分化系数Gst判断，当Gst＞0.25时，说明居群间分化程度非常高。本实验分析结果表明，栀子21个种源在总的遗传变异中有接近70.52%的变异发生在居群间（ISSR＋SRAP的Gst＝0.），29.48%的遗传分化存在于居群内。然而，一个物种居群内遗传多样性越高越有益于保护此物种的种质资源，因此，为更有效的管理和保护栀子种质资源，应该在栀子分布区不同居群之间较多的选取栀子种质个体。而基因流是基因在种群内和种群间的运动，基因流的强弱对种群分化具有重要影响，当Nm＞1时，基因流可防止遗传漂流引起的种群之间的遗传分化，本研究栀子种质Nm＝1.（ISSR＋SRAP混合数据），表明遗传漂流等因素引起的物种遗传多样性下降被基因流有效抵制。
从聚类结果看，取样栀子种质居群可分为2类，基于ISSR和两标记混合数据（ISSR＋SRAP）的聚类结果呈现出相互掺杂的现状，并没有严格按照地理距离的分布格局而分类。ISSR和SRAP的分子标记原理不同，揭示的基因组范围也不同，不同标记方法得到不同遗传距离，产生的聚类图不完全一致，而基于SRAP结果的UPGMA、PCoA结果显示栀子种质资源遗传距离聚类结果与不同地理位置分布基本一致，呈现一定地域性分布规律，但并不完全按照地理位置远近聚类。然而，基于ISSR、SRAP及两标记混合数据的聚类图中均将浙南居群的平阳种源、泰顺百年生种源、泰顺十年生种源、文成种源紧密聚在一起，表明这几个种源之间遗传差异较小。据温州市志等相关古籍记载，温州地区栽培栀子记载始于东晋时期，且规模化栽培已有多年历史，习称“温栀子”，平阳、泰顺一带为“温栀子”种源地。本研究结果证实了这一说法，表明温州产区的平阳、泰顺、文成种源亲缘性近；再则，20世纪末江西、湖南成为全国栀子的主要产区，因各地交通的便利促进了栀子产业的交流和发展，各地区交互引种开始频繁，3个聚类图中，泰顺二十年生种源和浏阳种源均被聚在一起，这预示着二十年前泰顺栀子产区和湖南浏阳之间可能有种源引种交流。
栀子为我国大宗药食两用药材之一，产区分布广泛，相互引种频繁，栽培类型多样，除有野生外还有庭院栽培、GAP基地种植等，因此栀子的种质资源遗传多样性高且亲缘关系复杂。本研究揭示了西南、华中居群重点产区的栀子种质遗传多样性，且首次报道了基于分子标记的浙江居群栀子遗传多样性，明确了浙南地区平阳、泰顺、文成种源的道地性，可为浙产栀子育种、分类和利用提供可靠的理论基础。
参考文献（略）
来源：姜武，吴志刚，陶正明，蔡胡敏.基于ISSR和SRAP标记的栀子种质遗传多样性研究[J].中草药,,50(2):-.
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