摘要：目的利用超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用（ultraperformanceliquidchromatographyquadrupole-time-of-flighthybridmassspectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）分析三七的主要化学成分，运用网络药理学研究三七抗炎的多成分、多靶标、多途径作用机制。方法通过UPLC-Q-TOF-MS分析三七的主要化学成分，使用DAVID数据库进行基因本体论（GeneOntology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）通路分析，并运用Cytoscape3.6.1软件绘制网络互作图，ImageGP工具绘制GO气泡图。结果研究得到人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg1、月桂酸单甘油酯（monolaurin）等22个关键抗炎作用的活性成分和表皮生长因子受体（EGFR）、信号传导蛋白和转录激活物3（STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶-14（MAPK14）等31个关键靶点。GO、KEGG通路富集分析发现，三七可能主要通过人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg1、月桂酸单甘油酯、β-胡萝卜苷（β-daucosterol）和人参环氧炔醇（panaxydol）等活性成分，作用于EGFR、STAT3、MAPK14、白介素-2（IL-2）等靶点，调节癌症信号通路（Pathwaysincancer）、细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokinereceptorinteraction）、突触细胞黏附分子（CAMs）等信号通路发挥抗炎作用。结论三七抗炎体现了多成分、多靶点、多途径的特点，为进一步开展三七抗炎作用药效物质基础和作用机制研究提供了新的思路和方法。
炎症是机体对各种炎症因子所致的损伤而发生的一种以防御为主的局部组织反应，包括局部组织的变质、变性、充血、坏死、体液和细胞的渗出与组织和细胞的增生，故局部以红肿热痛为主要表现，全身反应多见发热、白细胞增多，单核巨噬细胞增多，以及心脏、肝、肾的变性、坏死和功能障碍[1]。炎症的持续存在对机体是有害的，在很多重大疾病的发生、发展过程中起着重要作用。市面上已出现多种相关药物如非甾体类抗炎药和甾体类抗炎药，但长期大量使用会引发多种脏器的不良反应，因此在使用过程中有一定的局限性。中药在治疗炎症方面具有疗效较好、毒副作用小等优点，成为研究新热点[2]。
三七为五加科人参属植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的块根，具有止血、散瘀、定痛的功效。常用于治咳血、吐血、衄血、便血、外伤出血、跌打瘀痛、崩漏、产后血瘀腹痛、冠心病心绞痛等，是典型的中药材大品种[3]。目前，含三七中成药品种共计个，产品数量总计超过个。年，中华中医药学会发布了《中药大品种科技竞争力报告（版）》，我国中药品种批准文号近六万个，而入围的中药大品种个，其中有48个产品处方组成含三七[4]，高达8.7%。按照临床治疗领域对48个含三七的中成药大品种进行分析，这些产品的临床主要治疗领域较为集中分布在心血管病领域、骨骼肌肉用药和妇科用药3个领域，上述疾病的发生、发展均与炎症密切相关，但三七抗炎的具体作用机制尚不明确。
中药具有多成分、多靶点作用特点，导致研究其治病机制时存在困难。网络药理学是以系统生物学为基础，利用生物网络数据库、各种生物网络构建方法和生物网络分析技术，通过网络构建工具，系统阐述“药物-基因-靶点-疾病”之间复杂网络关系的一门交叉学科[5]。中医药研究的整体观与网络药理学的整体性相契合，将网络药理学的方法应用在中医药研究中已成为趋势。本研究拟将UPLC-Q-TOF-MS与网络药理学方法联合，预测三七抗炎活性成分、潜在作用靶点及作用机制，为三七临床应用和基础研究提供新的思路。
1仪器与材料
Acquity超高效液相色谱分析系统，Q-Tofmicro高分辨四级杆与飞行时间串联质谱仪（配有lock-spray接口），美国Waters公司；AcquityUPLCTMBEHC18反相色谱柱（50mm×2.1mm，1.7μm），美国Waters公司；BPD分析天平，德国Sartorius公司；DL-A超声波清洗器（50Hz，W），上海之信仪器有限公司；FRESCO17低温高速离心机，美国ThermoFisherScientific公司；MasslynxV4.1数据软件处理系统，美国Waters公司。
甲醇（HPLC级），德国Merck公司；乙腈（UPLC级），德国Merck公司；Lockmass脑啡肽（质量分数≥95%），美国Sigma公司，批号L-50MG；超纯水（优级），屈臣氏；甲酸（色谱纯），德国CNW科技公司；甲酸铵，Aladdin公司，批号。
2方法
2.1三七化学成分分析
三七于云南文山采集，经广东药科大学滕希峰副教授鉴定为五加科人参属植物三年生三七P.notoginseng(Burk.)F.H.Chen。取三七10g，粉碎，过5号筛，得药材粉末。精密称取三七粉末0.3g，置锥形瓶中，加入60%甲醇1.5ml，超声1h，吸取粗提液至离心管中，离心5min（转速1r/min、温度20℃）。随后取适量上清液至进样瓶中，4℃保存，备用。
色谱条件：色谱系统为WatersAcquityUPLC/Q-TOFMicroMS；色谱柱为AcquityUPLCBEHC18反相柱；柱温40℃；进样量10μL；体积流量0.3mL/min；二元梯度洗脱，流动相为0.2mol/L甲酸水溶液（含10mmol/L甲酸铵）-乙腈；梯度洗脱条件：0～1.0min，2%乙腈；1.0～2.0min，2%～10%乙腈；2.0～5.1min，10%～25%乙腈；5.1～6.1min，25%～32%乙腈；6.1～8.1min，32%～38%乙腈；8.1～8.6min，38%乙腈；8.6～9.1min，38%～50%乙腈；9.1～9.6min，50%～55%乙腈；9.6～12.5min，55%乙腈；12.5～14.0min，55%～70%乙腈；14.0～16.1min，70%～%乙腈；16.1～18.5min，%乙腈。
质谱条件：电喷雾离子源正离子模式（ESI+）：毛细管电压（capillary）：V，锥孔电压（samplecone）：20V，离子源温（sourcetemperature）℃，脱溶剂温度（desolvationtemperature）℃，脱溶剂N2体积流量为L/h，锥孔反吹N2体积流量为50L/h，脱溶剂气为N2，碰撞气体为Ar；采用Lockmass通路对实验数据采集进行实时校正，Lockmass对照品溶液为脑啡肽（10μg/mL），校正切换频率为10次/s，扫描范围为m/z50～1。正离子模式下的Lockmass分别为m/z.[6]。
根据UPLC-TOF-MS获得相应色谱峰对应化合物的精确相对分子质量，得到化合物的分子式，并通过文献进行对比，对化合物进行定性分析，筛选得到三七化学成分，然后在Pubchem数据库中查询CanonicalSMILES号。
2.2三七作用靶点预测
通过查询SwissTargetPrediction[7]数据库，将获得的CanonicalSMILES号上传，点击Predicttargets进行分析，输出化合物靶点信息[8]。将得到的化合物靶点信息导入Uniport[9]数据库中，选择物种为“HomoSapiens”，进行批量标准化，将审核过的基因下载。将审核过的三七主要活性成分的靶点与CTD[10]、Genecards[11]数据库中查询到的与抗炎（anti-inflammatory）有关的靶点进行对比分析，筛选出三七主要活性成分抗炎的潜在靶点。
2.3蛋白-蛋白相互作用网络构建（PPI）
将所得三七抗炎的潜在靶点导入String[12]数据库，选择“Multipleprotein”，物种选择为“人源”，得到蛋白相互作用关系，导出相关数据并导入Cytoscape软件，根据score值和degree值设定node和edge的颜色和大小粗细，最后得到蛋白相互作用网络图。
2.4GO功能与模块分析、KEGG富集通路分析
将筛选出的三七抗炎的潜在靶点输入DAVID（thedatabaseforannotation，visualizationandintegrateddiscovery）数据库进行KEGG（Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes）通路分析[13]和基因本体（geneontology，GO）生物学过程分析，以P＜0.05为筛选条件，得到相关分析结果。将DAVID数据库得到的GO富集分析结果导入imageGP数据库，得到GO分析结果。运用“MCODE”插件对所有具有统计学意义的GO生物过程聚类分析。
2.5三七提取物活性成分-靶点-通路网络构建
采用Cytoscape3.6.1软件中的Merge功能，构建三七提取物活性成分-靶点-通路网络图。其中，节点代表活性成分、靶点和信号通路，边用来连接活性成分、靶点和信号通路。
3结果
3.1三七主要化学成分
通过UPLC-Q-TOF-MS分析，得到三七总离子流图，见图1。显示主要有38个色谱峰，通过质谱提供的化合物相对分子质量信息，并与已知文献进行对比，总共得到个22化合物，主要包括月桂酸、monolaurin、β-daucosterol、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rg1等。具体成分见表1。
3.2活性成分靶点预测
按照方法“2.2”项中的方案，将审核过的个靶点下载，再应用GeneCards数据库搜索与抗炎（anti-inflammatory）相关的靶点有个，CTD数据库搜索相关靶点有个，2个数据库重复靶点有个。与上述个靶点比对分析后，得到31个三七抗炎的潜在作用靶点。主要包括表皮生长因子受体（EGFR）、信号传导蛋白和转录激活物3（STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶-14（MAPK14）、白介素-2（IL-2）等。详见表2。
3.3蛋白-蛋白相互作用网络构建
按照方法“2.3”项中的方案，最后得到蛋白相互作用网络图，见图2。由图2可知，该网络图中包含有31个靶点、条边，degree值越大，节点越大，而
