永辉-肿瘤免疫提问：吴老师，您好！取从-80度甘油保存的菌种小摇14h后，转大摇（14h）,收细胞提质粒时，菌体量比较多，但是提取出来的质粒的量非常少，想问您是什么原因引起？难道细菌经-80度冻存后质粒丢失了么？

我的个人经验：

1、摇的细菌越多，未必最终能提到更多的质粒。相反，当超出了试剂盒可以handle的量后，质粒的浓度质量是会下降的。因此，假如试剂盒说明书写着可以抽ml的量，那摇菌就绝对不要超过ml。

2、质粒的拷贝数是个关键。不是所有质粒都是高拷贝的，这一般取决于ori元件。但是，当质粒的超过一定大小，即使是高拷贝的ori，也会导致实际的拷贝数下降。我试过一个中拷贝ori的质粒，但是最终大小超过15kb，最后实际上看其实更像低拷贝。

3、有些大肠杆菌的菌株是endA+基因型。这个基因编码非特异dsDNA核酸内切酶，因此在用过柱抽提的时候，一定要加入试剂盒中推荐的额外试剂的洗涤步骤，否则会降低质粒得率。平时那个地方，是写optional的，但是，对于stbl3、HB、JM、NM、TG-1这些endA+的菌株，就不能省略。

此外，质粒丢失的菌，会因为失去抗性而死掉或者无法生长，过夜摇菌可以保证把其他含质粒的细菌给筛选出来，所以质粒丢失并不是主要因素。

Logro—基础医学—外泌体提问：老师您好，最近我们想从转基因小鼠身上分离自发瘤细胞株用于体外实验，细胞建系，和皮下注射构建移植瘤模型。其中体外实验主要看药物对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。有几个问题想请问一下老师:

我们是需要先建立细胞系，还是可以直接用分离的原代培养细胞进行体外实验？

我们查到的转基因小鼠细胞建系的文献和protocol很少，没有看到建系的明确标准，也没有明确的传代代数要求，请问这种建系方式要怎样找建系的标准呢？

是的，这方面确实非常缺行业标准。而所谓的标准，就是能搞出来就算成了。

实际上，不同组织来源的样品，处理起来可以有很大的不同。尤其是在消化组织这一步，不同组织来源的，所用的酶是可以差很远的，而目前并没有什么通用所有任何组织的酶。常用的酶有，typsin，trypLE，papain，各型collagenase，elastase等等。具体应该选择哪一种，就真的得去看你的组织类型，以及有没有相关的报道。如果没有，那就只能自己去试。

当消化完组织后，接下来要看的是，到底选择传统的贴壁型培养，还是养成organoid。我们从ATCC等公司买到的细胞系，绝大多数都是用贴壁长成单细胞层的方式，给建立起来的。现在越来越多人是走3D培养即organoid路线，据说能最大程度保留原始肿瘤的遗传特性。当然我并不是说，传统的贴壁单层培养就是不好的，毕竟简单成本又低。

而至于是否建系，那就看你的实验目的了。比如在临床做组织培养测试药敏，那是肯定不建系的，否则得花多长时间啊。但要是想永久保留一个模型，那就得建系了。因为原代肿瘤，在培养过程中，是会逐渐死掉一些细胞的，只有那些适应体外培养环境的，才存活并增殖开来。

霍子天提问：老师您好。请问一下，如果一个研究只是找到新的配体受体相互作用，然后能找到下游信号通路，然后能找到调控的核内转录因子。但是始终看不到明显的生物学功能怎么办。。。这种研究能发表么。。。

所谓的看不到明显生物学功能，应该是你没有找对模型。并不是所有的受体配体相互作用，都可以在任何一种细胞类型上产生明显的生物学功能的。

如果我来做这个研究，我会先去查，这个受体和配体的基因，在哪些组织细胞上表达量最高，然后我会去找相应的细胞系来测试。

其次，如果看不见一些很浅显的表观改变，比如增殖速度、细胞形态，这些都没有变化的话，应该只是还没找到正确的测量指标而已。如果我坚信，在之前选定的细胞模型中，肯定会产生什么功能的话，我会去做个RNA-seq，看看在受体配体相互作用下，会导致哪些基因发生差异表达，会聚类到什么molecularsignature上面，然后再去推受体配体相互作用的功能，再设计实验验证。

一一马普-单细胞测序提问：请问，人肿瘤细胞系，被支原体污染了，用药物处理治疗去除支原体后，再用来做实验，影响大吗？谢谢！

如果有可能的话，还是用全新的无污染的细胞来做。我给你讲3个故事：

1、我自己的。我以前也曾经头痛过支原体的问题，也用过抗支原体药，包括MP、invivogen等公司的。有的细胞，效果就很好，处理完了就不复发了。但有的就是不行，养几代就复发了。估计是和感染的支原体类型有关。实验反反复复的，还不如用新的细胞。

2、我知道有个小组，在研究exosome里面的DNA、RNA。之前用纯化的exosome去作用于细胞，做了一大堆表型实验，可high了。到最后他们决定去把exosome里面的东西测个序。结果最后mapping出来，全是支原体的东西。以前的那些表型实验，都白做了。

3、有另外一个组，发现了一个现象，就是一株细胞里面，有个小群体特别耐药。但是实验结果老不稳定，有的批次能做出来，有的批次就做不出来。后来发现，原来是感染了支原体，导致一些细胞膜上的药物泵表达量升高。所以之前的那些耐药，都是假象。

所以，支原体到底会不会影响你的实验，没有人可以给你打包票的。最好就是，换掉。

苒书-Intended生物本科提问：求问：为什么DNA用Thymine而非Uracil？不知道我询问后答案对吗；是否还有其他的答案。一，T的methylgroup可以防止DNA被识别并被nucleases切去（但我不知道为什么可以防止）。二，这个methylgroup会有hydrophobicinteraction从而防止和其他的错误的base结合。三，methylgroup可以和aminoacid结合，所以可能会被polymerase和transcriptionfactors等更好的结合。四，cytosine可能会变成uracil，如果用uracil的话，比较难修复。（资料来自mbotc.tumblr.