作者：付小梅孙菡刘婧裴建国吴志瑰黄潇

来源：江西中医药大学药学院，江西南昌

原标题：基于聚类分析和主成分分析的栀子指纹图谱研究

摘要：目的建立栀子的HPLC指纹图谱，为其真伪鉴别及质量评价提供依据。方法采用HPLC法建立栀子及其主要混淆品（水栀子、大红栀子）的指纹图谱，并通过HPLC-ESI-MS对指纹图谱中的色谱峰进行鉴定。同时采用聚类分析及主成分分析对样品进行分类分析。结果获得了栀子的HPLC指纹图谱，共有峰17个，鉴定出15个共有峰。聚类分析及主成分分析能将22批栀子类药材区分为栀子、水栀子、大红栀子。结论栀子指纹图谱的构建和化学模式识别为栀子的真伪鉴别和质量控制提供科学依据。

关键词：栀子；水栀子；大红栀子；指纹图谱；聚类分析；主成分分析；HPLC

中图分类号：R.6文献标志码：A文章编号：-()19--09

DOI:10./j.issn.-..19.

栀子为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的成熟果实，为历版《中国药典》收载，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒等功效。栀子在临床上应用广泛，早在张仲景所著的《金匮要略》、《伤寒论》里收载栀子药方达10余首，在国家标准中收载有栀子的处方达余首。《中国植物志》栀子属收载有栀子、匙叶栀子G.angkorensisPitard.、大黄栀子G.sootepensisHutchins.、狭叶栀子G.stenophyllaMerr.、海南栀子G.hainanensisMerr.共5种，1个变种即为白蟾G.jasminoidesEllisvar.fortuniana(Lindl.)，同时认为栀子变异有2种类型，即山栀子和水栀子。《常用中药材品种整理和质量研究》中“栀子类的研究”记载水栀子历来为正品栀子的混淆品，大黄栀子、海南栀子、狭叶栀子和匙叶栀子虽有分布，但商品药材很少见或根本不存在。《全国中草药汇编》记载水栀子即长果栀子G.jasminoidesEllisf.logicarpaZ.W.XieetOkada.和大红栀子G.jasminoidesEllisvar.grandifloraNakai，亦在地方作栀子入药。《中药品种理论与应用》谢宗万教授认为水栀子即为历代古本草记载的伏尸栀子，在部分地区作栀子入药。水栀子自古以来均不作药用，只作染料用。这与前期研究报道一致，即栀子为主流品种，其主要的混淆品为水栀子，其次为大红栀子。本实验应用指纹图谱技术与聚类分析和主成分分析（PCA）2种统计方法相结合对3类栀子药材的高效液相图谱进行了比较分析，并利用LC-MS技术对色谱峰进行了归属，为栀子类药材的鉴定提供科学依据，为临床用药安全提供依据。

1材料

1.1药材

从各地药材公司（药店）或产地共收购和采集了22个省、市（区）的栀子生药材及商品药材18份、水栀子3份、大红栀子1份，见表1。药材经江西中医药大学范崔生教授鉴定，分别为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实、水栀子G.jasminoidesEllisf.logicarpaZ.W.XieetOkada.的干燥成熟果实、大红栀子G.jasminoidesEllisvar.grandifloraNakai.的干燥成熟果实。

1.2仪器

Agilent型高效液相色谱仪（自动进样器，四元泵，柱温箱，DAD检测器，Agilent公司，美国），KQ-DB数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），BPD型电子天平（十万分之一，SatoriusCo.Ltd.，德国）。HPLC-PDA-MSN联用系统：高效液相系统为SurvyorLCsystem（ThermoFinnigan，SanJose，美国），包括在线脱气机、四元泵、自动进样器和PDA检测器；MS和MSn实验使用LCQDECAXPplus质谱仪（ThermoFinnigan公司，美国）包括ESI离子源和离子阱系统。

1.3试剂

对照品京尼平苷酸、去乙酰基车叶草苷、羟基栀子苷、鸡矢藤次苷甲酯、京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷、对香豆酰京尼平龙胆双糖苷、西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3为自制，质量分数经高效液相按面积归一化法测定均大于98%。甲醇、乙醇、醋酸均为分析纯（上海国药集团化学试剂有限公司），乙腈色谱纯（Merck公司），自制双蒸水。

2方法

2.1色谱和质谱条件

2.1.1HPLC-DAD色谱条件

色谱柱AgilentZorbaxSB-C18（mm×4.6mm，5μm），流动相乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B）洗脱，0～10min，

6%A；10～18min，6%～12%A；18～22min，12%～16%A；18～28min，16%～20%A；28～40min，20%A；40～60min，20%～36%A；60～65min，36%～55%A；平衡时间10min；体积流量1.0mL/min；进样量5μL；柱温30℃；DAD检测器采集范围：～nm；检测波长、nm。2.1.2LC-MS条件流动相为乙腈（A）-0.2%冰醋酸溶液（B），洗脱程序与上述条件相同；柱后分流，分流比为1∶50；进样量10μL；柱温30℃；ESI源；源电压?3.2kV；负离子模式；雾化气（GAS1）.33kPa，帘气（CUR）.32kPa，去簇电势（DP）?20V，聚焦电势（FP）?80V，去簇电势2（DP2）?20V。质谱扫描质量范围m/z～。

2.2样品提取条件的优化

根据现有的文献报道[5-8]，栀子指纹图谱的研究主要集中在环烯醚萜类和西红花酸类成分的指纹图谱。这2类成分均为中等或大极性成分，易溶于甲醇、乙醇等极性溶剂。因此通过比较以30%、50%、70%、%甲醇及30%、50%、70%、%乙醇为溶剂分别超声20、30、40min的提取率，发现70%甲醇与70%乙醇提取率无明显差异，但乙醇毒性小。

最终优化的提取方法：取栀子药材粉末（过40目筛）0.40g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，称定质量，超声（25℃）30min，放冷，称定质量，用70%乙醇补足减失质量。r/min离心10min；取上清液，微孔滤膜滤过，即得。

通过HPLC的可变波长功能同时测定环烯醚萜类和二萜类成分，得到成分相互分离图谱，图谱中共显示出环烯醚萜类和二萜类成分20多个色谱峰。

2.3溶液的制备

2.3.1对照品溶液的制备取对照品京尼平苷酸、去乙酰基车叶草苷、羟基栀子苷、鸡矢藤次苷甲酯、京尼平龙胆双糖苷、京尼平苷、对香豆酰京尼平龙胆双糖苷、西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3适量，精密称定，用甲醇溶解，分别制成含上述对照品50、15、50、80、80、、、50、50、50μg/mL的溶液，作为对照品溶液。

2.3.2供试品溶液的制备精密称取栀子药材粉末（过40目筛）0.40g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，称定质量，超声（25℃）30min，放冷，称定质量，用70%乙醇补足减失质量。r/min离心10min；取上清液，微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验取同一份供试品溶液（编号Z23），按照“2.1.2”项色谱条件，连续进样5次测定，以京尼平苷峰为参照峰，分别计算17个特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值，均小于3%，说明仪器精密度良好。

2.4.2稳定性试验取同一份供试品溶液（编号Z23），按照“2.1.2”项色谱条件，分别于1、3、5、7、9、12、24和48h进样测定，以京尼平苷峰为参照峰，分别计算20个特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值，均小于3%，说明样品溶液在48h内稳定。

2.4.3重复性试验同一样品粉末分别精密称取5份（编号Z23），按照“2.3.2”项方法制成供试品溶液，按照“2.1.2”项色谱条件，进样检测。以京尼平苷峰为参照峰，分别计算20个特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，均小于3%。说明该方法的重复性良好。

2.5耐用性实验

取同一供试品溶液，分别使用ThermoHypersilODS（mm×4.6mm，5μm）、KromasilODS（mm×4.6mm，5μm）、WaterssymmetryODS（mm×4.6mm，5μm）、AgilentSB-C18（mm×3.0mm，3.5μm）、AgilentSB-C18（mm×4.6mm，5μm）、AgilentXDB-C18（mm×4.6mm，5μm）5个不同品牌的ODS色谱柱进行检测，记录色谱图。其中AgilentSB-C18（mm×4.6mm，5μm）柱能使栀子各色谱峰得到较好的分离，分离度好、柱效高。因此实验最终选用AgilentSB-C18色谱柱。考察了2根AgilentZorbaxSB-C18色谱柱的重现性（PN-，SNUSCL053，BNLNB；PN-，SNUSCL，BNLNB），取同一供试品溶液在2根AgilentSB-C18谱柱上测试，结果色谱行为有较好的一致性。

3结果与分析

3.1栀子的指纹图谱分析

京尼平苷、西红花苷-1在线紫外光谱图显示这2个化合物的最大吸收波长分别为、nm，因此选定、nm作为检测波长。贾琳等[9]利用HPLC的可变波长功能在一张色谱图上同时表征了京尼平苷和西红花苷-1的色谱峰。栀子药材的色谱图表明，在nm波长检测下，保留时间43min前为环烯醚萜类成分的色谱峰（图1-A）；而在

nm波长检测下，保留时间43min前几乎没有色谱峰，43min后为西红花素类成分的色谱峰（图1-B），因此利用HPLC的可变波长功能将2类成分在一张色谱图上同时表征（图1-C）。

采用上述已建立的指纹图谱方法，分别对收集的18批不同产地或收集地栀子药材样品、1批大红栀子和3批水栀子进行了HPLC-DAD指纹图谱测定，并按上述方法将2类成分合在一张色谱图上，结果见图2。在栀子药材指纹图谱中，京尼平苷（7号峰）既是该指纹图谱中的最强峰，又是有效成分。故以其为参照峰（S），选取18批药材中都含有的17个特征峰作为栀子药材指纹图谱的共有峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，见表2、3。

结果显示，这些栀子药材化学成分的分布具有相似性，每批药材被检测的色谱峰数目几乎相等；在环烯醚萜类成分中，京尼平苷的色谱峰占非常高的比例，最高达58.18%，最低有47.34%，平均为52.84%，说明该化合物是环烯醚萜类成分的主要成分之一，也是药材中主要成分之一。在西红花素类成分中，西红花苷-1的色谱峰占更高的比例，最高达66.56%，最低有54.99%，平均为61.68%，说明该化合物是西红花素成分的主要成分之一，也是药材中主要成分之一。西红花素成分以5个色谱峰为主，平均占西红花素成分的95%以上，西红花苷-1、西红花苷-2、西红花苷-3平均占西红花素成分的76%

以上。17个共有峰中有2个共有峰峰面积归一化值大于20%，即京尼平苷和西红花苷-1，就这2个主要成分来说，药材之间的相互差异比较小，18批药材，京尼平苷、西红花苷-1的RSD分别为7.24%、4.19%；其余共有峰峰面积归一化值均小于10%，RSD在20%以上。

3.2HPLC指纹图谱主要色谱峰的LC-MS鉴定

为了尽可能多地了解HPLC指纹图谱中各成分的结构信息，实验采用LC-ESI-MS对栀子样品进行进一步分析，结合对照品及与文献对照[10-12]，确定了15个色谱峰的归属，其中14个峰通过对照品鉴定归属。分析和指认的结果见图3、4和表4。

3.3栀子类药材的指纹图谱直观比较

根据上述栀子指纹图谱条件，获得了水栀子、大红栀子的指纹图谱，色谱图及特征峰面积归一化值见图2和表5、6。从3类栀子药材的高效液相图谱结果显示，水栀子、大红栀子的指纹图谱中可以找到与栀子保留时间一致的17个共有峰，但是各成分的含量差异比较大，而且在水栀子、大红栀子都出现差异成分，见图5、6。

3.4栀子类药材指纹图谱的系统聚类分析

系统聚类分析（clusteranalysis，CA）又称集群分析，是按“物以类聚”原则研究事物分类的一种多元统计分析方法，根据样本的多指标（变量）、多个观察数据，定量地确定样品、指标之间存在的相似性或亲疏关系，找出一些能够度量样品之间相似程度的统计量，以这些统计量作为划分类型的依据，把相似程度较大的样品聚合为一类，相似度高的聚合到一个小的分类单位，相似度低的聚合到一个大的分类单位，直到把所有的样品聚合完毕，构成分类树状图。

采用组间均联法（between-groupslinkage），以欧式距离平方（squaredeuclideandistance）作为样品的测度，对22批药材采用系统聚类分析法进行模式识别分析。聚类分析的结果见图7。

根据聚类分析的树状图，22份样品被分成了3大类：第1大类为栀子药材（除上海华宇药业）；第2大类为水栀子药材；第3大类为大红栀子药材，这与药材的性状鉴别结果是一致的。

18份栀子药材除上海华宇药业收购的栀子（Z1）外均聚为一类，Z1药材外观性状为灰棕色，里面种子团为暗黄色，可能为近成熟的干燥栀子果实，其HPLC图谱表明京尼平苷峰面积归一化值几乎为最低值、西红花苷-1峰面积归一化值最小，其他成分也较低，说明Z1栀子药材质量较差，从而使其成为离群样本。

3.5栀子类药材指纹图谱的PCA

PCA是一种掌握主要矛盾的统计方法。PCA通过线性变换，将原来多个指标组合成相互独立的少数几个能反映总体信息的指标，即以最少的丢失信息为代价，将众多的观测变量浓缩为少数几个因子，该方法对于多元复杂事物的研究具有重要意义，它可以从多元事物中揭示现象的主要方面，找出事物发展的主要倾向，帮助人们了解生命活动的规律，从而达到掌握和认识生命现象的本质。

按上述指纹图谱方法建立22批样品的HPLC色谱图，采用二极管阵列检测器（DAD），记录每个色谱峰在全波长（～nm）的紫外吸收光谱图。以每个色谱峰的保留时间为定性指标，以峰高为定量指标，以京尼平苷为参照峰，统计各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。选择斜率大于5，峰宽大于0.05，峰高大于5的色谱峰，结合各色谱峰的相对保留时间和紫外吸收特征确定了22批样品的32个特征峰（各批次样品中相对保留时间差异允许在1%范围内），运用MVSP3.1（Multi-VariateStatisticalPackage）软件，对上述的22×32阶的数据矩阵进行PCA，结果如下，从表7所示，前3个主成分的累积贡献率可达79.%，前4个主成分的累积贡献率可达88.%，说明通过引用前4个主成

分即可以代表样品88%以上的信息，证明该组数据有突出的成分可以依据，适用于PCA。第一主成分的贡献率为39.%，第二主成分的贡献率为27.%，见图8。依据每个样本的得分（PCAcasescores）所作的22个样本的分布图。从图8中可以看出，22个样本可分为A、B、C3个区，其中A区为栀子药材样本，B区为水栀子药材样本，C区为大红栀子药材样本。Z1为上海华宇药业收购的栀子，为离群样本。

因此，3种药材的系统聚类分析结果与PCA结果是一致的，均能将栀子、水栀子、大红栀子药材区别开来，而且能区分劣质的栀子药材。

4讨论

江西为栀子的道地产区，所产栀子因皮薄、色红、饱满、品质优良，被称为“小红栀”，畅销全国及东南亚地区。国内学者主要是对不同产地栀子的指纹图谱研究较多，但对栀子属其他药材如水栀子、大红栀子的指纹图谱研究几乎没有报道。因此本实验建立了不同产地的栀子及市场上栀子的主要混淆品的高效液相指纹图谱，标记了17个共有峰，比较全面反映了3类栀子药材的化学成分信息，方法简单、快捷。

栀子、水栀子及大红栀子3类药材的指纹色谱的色谱峰个数几乎相同，仅含量差异大。进一步应用聚类分析及PCA对指纹图谱进行了综合分析，发现能将栀子、水栀子、大红栀子3类药材区别开来，同时能将颜色不合格的栀子药材区分出来，说明颜色这一性状鉴别特征是栀子质量标准的重要标志。

栀子中含有环烯醚萜类、西红花素类、黄酮类、有机酸类等成分，国内外学者[13-14]应用LC-MS对栀子中的多个成分的鉴定较少，主要集中于少数几个含量高的成分，比如环烯醚萜类如京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷，西红花素类如西红花苷-1、西红花苷-2。本实验采用LC/MS对栀子类药材的高效液相指纹图谱的色谱峰进行了归属，共鉴定15个色谱峰，其中14个色谱峰通过对照品对照鉴定，提高了鉴定的准确度，对栀子及其制剂的质量鉴定具有十分重要的意义。