白癜风治疗方法 http://news.39.net/bjzkhbzy/171226/5959473.html

摘要：目的比较栀子炒制前后化学成分差异，明确其差异标志物，为栀子与炒栀子质量标准的制定提供参考。方法采用全-精细指纹图谱和多指标含量同时测定对栀子炒制前后样品进行分析，采用层次聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）等多元统计分析对栀子与炒栀子指纹图谱进行比较，筛选出导致差异的特征性成分。结果栀子炒制前后指纹图谱中共有15个峰，其中12个峰为两者所共有，栀子与炒栀子对照指纹图谱的全指纹图谱相似度为0.，而去除栀子苷积分后建立的精细指纹图谱相似度为0.，低于0.90，可基本实现两者区分；多元统计分析结果表明栀子与炒栀子可明显分为2类，并筛选得到贡献度较大的4个差异标志物，分别为峰3、5、9（栀子苷）、11（西红花苷I）；含量测定结果表明栀子炒制后栀子苷、西红花苷I、西红花苷II含量显著降低，而去乙酰车叶草酸甲酯含量显著升高。结论栀子炒制前后成分差异显著，建立的精细指纹图谱结合多成分含量测定方法可有效区分栀子与炒栀子，筛选得到的差异标志物可为其质量标志物的选择提供参考。

栀子始载于《神农本草经》，为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实[1]，现收载于《中国药典》年版，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒功效[2]，炒栀子为栀子照清炒法炒至黄褐色所得炮制品，炒制后可缓解其寒性，减少对肠胃的刺激[3-5]。随着中药现代化、国际化进程的加快，中药质量标准不断完善，中药“饮片炮制前后的成分变化”“生熟异治中药饮片有别于中药材的专属性鉴别指标研究”等已列入《中国药典》年版重点开展的工作[6]。《中国药典》年版栀子项下针对栀子和炒栀子均只对栀子苷含量进行限定，仅靠栀子苷单一指标不能全面反映栀子与炒栀子饮片的质量，因此对栀子炒制前后化学成分差异进行系统研究，明确其差异标志物，对栀子及其炮制品质量标准的提升非常有必要。

指纹图谱可以较为全面地反映中药所含化学成分，已成为中药质量全面控制的一种重要手段；指纹图谱结合多元统计分析可用于不同产地、基原、炮制品的差异评价，筛选得到其差异标志物[7-15]。因此为明确栀子炒制前后化学成分变化及其差异标志物，本实验采用课题组前期建立的栀子指纹图谱和多指标成分含量测定方法[9]，对栀子与炒栀子全/精细指纹图谱及去乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷I和西红花苷II5种指标成分含量进行分析，进而结合聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）多元统计分析方法对栀子及炒栀子化学成分差异进行全面评价，明确其差异标志物，为栀子和炒栀子质量标准的建立及质量标志物的选择提供参考。

1仪器与材料

Agilent高效液相色谱仪，四元泵，自动进样器，柱温箱，DAD检测器，AgilentChemstation（C.01.03）色谱工作站，美国安捷伦科技有限公司；KH-E型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；FA电子分析天平，上海良平仪器仪表公司；MT-5精密天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；Milli-Q超纯水制备仪，SynergyTM超纯水系统，美国Millipore公司；高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。

对照品栀子苷（批号-，质量分数≥97.6%）、西红花苷I（批号-，质量分数≥92.6%）、西红花苷II（批号-，质量分数≥92.2%）、去乙酰车叶草酸甲酯（批号-，质量分数≥94.3%），均购自中国食品药品检定研究院；对照品京尼平龙胆双糖苷（批号LW，质量分数≥98%）购自南京良纬生物科技有限公司；以上对照品均为含量测定用。乙腈，HPLC纯，Tedia公司；水为实验室自制超纯水；其余试剂均为分析纯。

10批栀子采集于江西抚州，经南京中医药大学邹立思实验员鉴定为茜草科栀子属植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实，样品批号分别为、、、、、、、、、，编号S1～S10。

2方法与结果

2.1炒栀子的制备

取10批（S1～S10）净栀子，照清炒法（《中国药典》年版通则）炒至黄褐色，即得炒栀子，编号CS1～CS10。

2.2栀子与炒栀子饮片HPLC全-精细指纹图谱的建立

2.2.1指纹图谱方法参照本课题组前期建立的栀子药材指纹图谱分析方法[9]，并以CS1作为供试品溶液进行方法学考察，以9号峰（栀子苷）为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积。精密度、稳定性、重复性结果均表明各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3%，表明建立的方法同样适用于江西抚州栀子与炒栀子指纹图谱的分析。

2.2.2栀子与炒栀子共有峰的标定取10批栀子与炒栀子样品，进行指纹图谱分析，得10批栀子与炒栀子样品HPLC色谱图。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（A版）进行色谱峰匹配，样品S1和CS1图谱分别作为参照图谱，选择中位数法生成对照图谱，采用多点校正法建立指纹图谱，得到栀子与炒栀子全指纹图谱，见图1-A、B，全指纹图谱的对照指纹图谱见图2-A、B，以峰面积大于总峰面积0.5%的色谱峰作为共有峰，栀子共标定了12个共有峰，炒栀子共标定了15个共有峰，共有峰的总面积均占样品总峰面积的90%以上，峰3、6、10在炒栀子中含量较高，标定为共有峰，而栀子中此3个峰峰面积较小，未被标定为共有峰。栀子炒制前后，除8号色谱峰峰面积变化无显著性差异（P＞0.05），其他14个共有峰炒制前、后变化显著（P＜0.01），栀子炒制后峰1、2、5、7、9、11～15峰面积降低，峰3、4、6、10峰面积升高。样品共有峰中4、8、9、11、12号峰得到了化学指认，依次为乙酰车叶草酸甲酯、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷I、西红花苷II。

2.3指纹图谱相似度评价

2.3.1全指纹图谱相似度根据全指纹图谱计算每批样品指纹图谱相似度，每批栀子与其对照指纹图谱相似度分别为0.、0.、1.、1.、0.、0.、1.、1.、0.、0.，炒栀子与其对照指纹图谱相似度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、1.、1.、0.，表明不同批次栀子与炒栀子质量一致性较好；每批栀子与炒栀子对照指纹图谱相似度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.，每批炒栀子与栀子对照指纹图谱相似度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.，同批次栀子与炒栀子相似度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.，且栀子对照指纹图谱与炒栀子对照指纹图谱相似度为0.，相似度均高于0.98，而一般相似度高于0.90，即被认定为同种样品，因此根据全指纹图谱相似度结果完全无法区分栀子与炒栀子。

2.3.2精细指纹图谱相似度由于栀子苷峰面积远高于其他色谱峰，在进行相似度计算时，其权重较大，掩盖了其他色谱峰的贡献，不能反映栀子炒制前后细微变化，因此将各批次样品中栀子苷不进行积分，得到栀子与炒栀子精细对照指纹图谱（图3-A和B），并再次进行相似度评价，结果每批栀子与其对照指纹图谱相似度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.，炒栀子与其对照指纹图谱相似度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.，相似度均高于0.90；而每批栀子与炒栀子对照指纹图谱相似度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.，每批炒栀子与栀子对照指纹图谱相似度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.，同批次栀子与炒栀子相似度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.；且栀子对照指纹图谱与炒栀子对照指纹图谱相似度为0.，相似度均显著降低，因此精细指纹图谱与全指纹图谱相比基本可以实现栀子与炒栀子的区分，且能更好地反映样品批次间差异。

2.4栀子与炒栀子指纹图谱多元统计分析

2.4.1HCA将栀子与炒栀子共有峰的峰面积数据输入悟空平台（