中科白癜风医院康复经历分享 https://m-mip.39.net/baidianfeng/mipso_5154121.htmlKristinaM.Niculovic,1LindaBlume,1HenriWedekind,1ElinaKats,1IrisAlbers,1StephanieGroos,2MarkusAbeln,1JessicaSchmitz,3EstherBeuke,4JanH.Br?sen,3AnetteMelk,4MarioSchiffer,5BirgitWeinhold,1AnjaK.Münster-Kühnel1
本刊负责人：医院
点评：杨倩丁医院肾内科
翻译：王立华医院肾脏病血液净化科
审校：蒋更如上海交通大医院
点评FSGS治疗的新靶点：足细胞唾液酸化
足细胞损伤是蛋白尿发生的主要原因，在肾小球疾病的发生及进展中起重要作用。足细胞糖蛋白存在高度唾液酸化，唾液酸代谢相关酶类突变可致足细胞病变及小鼠蛋白尿形成，提示唾液酸化参与足细胞稳态的维持[1,2]。既往对微小病变型肾病的研究发现，嘌呤霉素可诱导足细胞糖蛋白去唾液酸化，应用唾液酸前体-N-乙酰基-D-氨基甘露糖(N-Acetvl-D-mannosamine，ManNAc)干预可显著改善嘌呤霉素小鼠及体外培养人足细胞的细胞损伤[3,4]。但这些研究均没有应用特异性针对足细胞的处理措施，无法排除其他肾小球细胞的影响而独立探讨唾液酸化对足细胞的作用。因此，构建足细胞特异性唾液酸代谢相关酶类突变/缺失模型，对明确唾液酸化在足细胞损伤中的作用意义重大。
CMP-Sia合成酶（CMAS）是糖蛋白和糖脂蛋白完成唾液酸化，转运至细胞表面的重要代谢酶。Niculovic等[5]通过构建足细胞特异性CMAS敲除小鼠模型（PCmas-/-）及建立永生化唾液酸化缺陷足细胞系评价唾液酸化对足细胞稳态的影响。结果发现（PCmas-/-）小鼠出现类似于FSGS的表型，表现为敲除鼠28天时出现足细胞足突融合与裂孔隔膜消失，并逐渐进展至足细胞缺失、毛细血管腔扩张、系膜细胞过度增殖及黏连形成。相关体外研究发现，唾液酸化缺失对足细胞增殖和分化能力无明显影响，但可致其胶原粘附能力显著下降，提示唾液酸化可影响足细胞与肾小球基底膜的相互作用。这些发现表明唾液酸化缺失可能是导致FSGS的一种病理机制，唾液酸化可能成为治疗或延缓FSGS或其他肾小球疾病的一个新靶点。
Niculovic等的发现为唾液酸化作为FSGS诊治的新靶点提供了理论依据，但该依据还需进一步验证。本研究及既往研究均未评价FSGS及其他肾小球疾病患者足细胞糖蛋白或糖脂蛋白的唾液酸化水平，其对FSGS及其他肾小球疾病的诊断意义还需相关研究证实。既往虽有研究证实了ManNAc对MCD模型足细胞损伤的治疗作用，但其对FSGS及其他肾小球疾病治疗作用还需进一步研究验证。
全文背景
包括局灶节段性肾小球硬化（focalsegmentalglo-merulosclerosis,FSGS）在内的激素抵抗型肾病综合征的发病机制尚未完全阐明。虽然已知肾小球内皮细胞糖萼结构异常与肾病综合征模型相关，但糖基化异常作为病理过程的因素之一并未被重视。多糖常被唾液酸（sialicacid,Sia）修饰，而唾液酸化对肾功能的作用早已被人熟知。人足细胞是高度唾液酸化的细胞，但唾液酸化在足细胞中的作用尚不清楚。
方法
我们以CMP-Sia合成酶为靶点建立了一个足细胞唾液酸化缺陷的小鼠模型（Podocyte-specifificCmas-knockoutmice,PCmas-/-），并利用组织学和超微结构分析明确其表型。同时利用CRISPR/Cas9技术建立永生化唾液酸化缺陷足细胞进行功能研究。
结果
PCmas-/-小鼠唾液酸进行性丢失，导致在出生后28天出现了蛋白尿，同时发生足突融合与裂孔膜缺失。足细胞损伤造成严重肾小球损害，包括毛细血管腔扩张、系膜细胞增生、粘连形成和足细胞丢失。体内实验发现，去唾液酸化将导致裂孔膜成分定位异常，而足糖萼蛋白定位正常。体外实验发现，去唾液酸化足细胞仍然能够增殖和分化，但Ⅳ型胶原粘附能力受损。
结论
小鼠细胞表面去唾液酸化将影响足细胞稳态并导致FSGS。足细胞粘附肾小球基底膜的能力受损可能是主要的致病原因。本研究结果支持唾液酸化缺陷可能参与FSGS的复杂发病机制。因此，以补充唾液酸为代表的唾液酸化治疗可能是治疗或延缓FSGS或其他肾小球疾病的一个全新治疗策略。
局灶节段性肾小球硬化（focalsegmentalglomerulo-sclerosis,FSGS）是导致终末期肾病（endstagerenaldisease,ESRD）的一种常见肾小球损伤类型，其发病率在全球范围内逐年增加[1-3]。FGFS是一种病理分型，而不是一种疾病，表现为部分（局灶）肾小球和（或）肾小球部分毛细血管袢（节段）发生硬化病变[4]。尽管基因突变、体内循环因子、药物因素等已被证实可导致或促进FSGS发生，但FSGS的发病机制仍未完全阐明[5,6]。而足细胞损伤这一共同的主题统一了FSGS。足细胞是一种高度特异性细胞，具有足突（footprocesses,FP）结构，并由裂孔膜（slitdiaphragm,SD）连接，形成肾小球滤过膜的最外层结构。与其他有孔内皮细胞一样，足细胞表面有致密的多糖覆盖，后者是由糖缀合物、蛋白聚糖和氨基葡萄糖组成的网状结构，这些亦是肾小球基底膜（glomerularbasementmembrane,GBM）的主要成分[7,8]。内皮细胞糖萼成分的改变会导致糖尿病及心血管疾病等多种常见病发生蛋白尿。此外，慢性肾脏病患者发生肾功能衰竭以及肾脏综合征的实验模型均与内皮细胞糖萼结构发生改变有关[9-12]。然而，糖萼对足细胞的作用尚不清楚。带负电荷的糖唾液酸（sialicacid,Sia）主要分布于细胞表面糖缀合物外部，在肾小球滤过功能中起重要作用。糖蛋白和糖脂蛋白在高尔基体内完成唾液酸化，之后通过分泌囊泡转运至细胞表面，这一过程严格依赖活化的糖供体底物CMP-Sia的利用度，后者由CMP-Sia合成酶（CMP-Siasynthetase,CMAS）产生（补充资料图1）。与唾液酸重新生物合成（N-乙酰甘露糖胺差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶[N-acetylglucosamineepimerase/N-acetylmannosaminekinase,GNE]，补充资料图1，GneMT/MT）[13]或代谢激活（Cmasnls/nls）[14]相关的酶发生突变，细胞唾液酸化能力普遍下降的小鼠出现蛋白尿，并在3天内死于肾衰竭。此外，在亚效等位基因突变Cmasnls/nls小鼠中发现唾液酸化通路障碍对足细胞影响最大，表现为足细胞发育成熟缺陷。唾液酸化能力下降导致上述小鼠模型出现过早死亡，并且多糖去糖基化药理通路（例如，神经氨酸酶注射）会导致肾小球各种细胞损伤[15,16]，因此细胞特异性的唾液酸化作用在这些模型中的确切作用并未阐明。为了探讨唾液酸对足细胞稳态的作用，我们建立了一个以CMAS为靶点的足细胞特异性敲除小鼠模型，CMAS是所有唾液酸糖缀合物的重要酶类。我们通过不同的模型已经证实干扰CMAS的正常表达可导致糖蛋白和糖脂蛋白的唾液酸化丢失（见补充资料图1）[17,18]。
方法
具体的抗体和凝集素信息见补充材料表1。引物信息见补充材料表2，具体实验方法见补充材料部分。
小鼠
携带floxedCmas等位基因的Cmasfloxed小鼠[17]与（NPHS2）-Cre小鼠[19]杂交产生足细胞特异性Cmas敲除小鼠（PCmas-/-）。PCmas-/-小鼠和携带猿猴病毒40大T抗原基因的H-2Kb-tsA58转基因小鼠杂交产生ImPCmas-/-小鼠[20]。小鼠在汉诺威医学院动物管理所无特殊致病环境中培育。所有动物实验均遵守德国动物保护法并获得当地政府批准（TV33.9__04_16/and33.14__04_13/;33.19__05_18A）。
基因型检测
通过利用分离的基因组DNA和高保真DNA聚合酶进行的聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）分析（NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA）确定小鼠、组织或分离细胞的基因型。PCR产物的分析利用1%-1.5%的琼脂糖凝胶配合GeneRulerbpPlusDNA梯状条带（ThermoFisherScientific,Waltham,MA）完成。
尿液分析
通过OlympusAU化学分析仪（OlympusDeuts-chlandGmbH,Hamburg,Germany）分析尿液标本中的肌酐和总蛋白[14]。
GFR检测
通过既往报道过的经皮异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）-左旋糖测定PCmas-/-小鼠与对照组小鼠的肾小球滤过率（glomerularfiltrationrate,GFR）[21]。即将小鼠麻醉后，眼球后注射FITC-左旋糖（7.5mg/g体重），利用经皮GFR监测仪（MediBeaconGmbH,Mannheim,Germany）在注射前后测定荧光信号。通过计算小鼠血液中的FITC-左旋糖半衰期来测定GFR。
电子显微镜术
标本的制备和分析按照既往报道的方法进行[14]。
肾组织和细胞裂解液制备
利用Triton缓冲液（1%Triton-X-,20mMTrisHClpH8.0,50mMNaCl,0.1mMEDTA,20mMChaps,3mMATP,Uml-1aprotinin,10μgml-1leupeptin,1mMPMSF,50mMNaF,2mMNa3VO3）制备肾组织匀浆。利用RIPA裂解液裂解足细胞。在进行蛋白质印迹分析前需对唾液酸酶进行处理，即将等分匀浆液加0.05U/mg蛋白节杆菌唾液酸酶（EYLaboratories,SanMateo,CA）置37℃孵育30分钟。
蛋白质印迹分析
如前所述进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrop-horesis,SDS-PAGE）和蛋白质印迹分析[14]。将经校正的蛋白总量进行分离、封闭，加一抗进行孵育（O/N，4℃）后再加入二抗进行孵育（1小时，室温[roomtemper-ature,RT]）。通过增强化学荧光法观察过氧化物酶偶联抗体；通过BCIP/NBT显色法观察碱性磷酸酶偶联抗体。
细胞培养
利用差异筛分法在无菌肾小球中分离得到永生化足细胞细胞系。利用洛斯维·帕克纪念研究所（RoswellParkMemorialInstitute,RPMI）-培养基（Biochrom,Berlin,Germany）培养I型胶原（Corning,Corning,NY）涂层细胞培养板，该培养基包括10%的胎牛血清（fetalcalfserum,FCS）（LifeTechnologies,Carlsbad,CA）、1%的青霉素/链霉素（Biochrom）和20Uml-1的γ-干扰素（interferonγ,IFNγ）（Peprotech,Hamburg,Germany），培养基温度为33℃，CO2浓度为5%。在培养基温度为37℃、CO2浓度为5%、IFNγ消化条件下，分化培养足细胞10-14天[22]。对足细胞克隆进行支原体污染检测，结果呈阴性。
足细胞免疫染色
将足细胞接种于1型胶原（BDBiosciences,FranklinLakes,NJ）涂层盖玻片，培养24小时，固定于4%的PFA中，并用0.2%的Triton-X透性化处理。在RT下，置1%的牛血清清蛋白（Bovineserumalbumin,BSA）中进行封闭和抗体孵育1小时。之后利用含有Vectashield封片剂（Vectorlabs,Burlingame,CA）的DAPI进行封片。
Cmas-/-足细胞构建
以Cmas外显子4（5-TGTCGACGAGGCCGTTTCGC-3）的RNA靶向残基11,-11,为引导，利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑生成Cmas-/-足细胞。靶向序列克隆至质粒pX-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9（Addgeneplasmid#fromFengZhang[23]）。野生型足细胞与生成的质粒和含有新霉素抗性基因（pcDNA3；Invitrogen,Carlsbad,CA）的空载体共转染（比例10:1）。根据生产商协议，由FuGene（Promega,Madison,WI）进行转染。转染24小时后，利用μg/mlG（Merck）筛选细胞5天，并通过有限稀释法获得单细胞克隆。利用PCR进行克隆筛选，并通过引物KMB77和KMB78对产物进行测序。
体外细胞增殖实验
为了分析细胞增殖，将足细胞细胞系以3,细胞/每孔的密度接种于I型胶原包被的96孔板，每个时间点设置三个复孔。在24、48、72、96小时后，将10μlWST-1试剂（Roche,Basel,Switzerland）加入复孔，置33℃孵育4小时。在nm波长测量其反应（参考波长为nm）。无细胞孔作为空白对照。在不同的天数进行三个独立实验。
体外细胞粘附实验
对永生化野生型和Cmas-/-足细胞克隆进行细胞粘附实验。O/N分别与1%BSA、10μg/mlⅣ型胶原（人胎盘；SigmaAldrich,St.Louis,MO）、10μg/ml层粘连蛋白（Biolamina,Sundbyberg,Sweden）在4℃下包被于96孔板。利用PBS将孔板清洗2次后，以1%BSA置37℃封闭30分钟。在RPMI培养基（无补充剂）中，将足细胞以1×的密度接种于被覆小孔板，并在37℃下粘附基质1小时。之后用PBS冲洗小孔板2次，4%PFA固定，用Hoechst进行细胞核染色。记录每个小孔板的代表性图像，并取6个小孔板细胞数的平均值。进行3次独立实验，细胞计数用BSA对照组进行标化。
统计学分析
采用非配对t检验比较两组数据（*P0.5,**P0.01，***P0.，****P0.1）。采用非参数Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较分析尿蛋白与肌酐比值（**P0.01，***P0.）。利用GraphPadPrism5软件进行统计学分析。
结果
足细胞特异性CMAS-敲除（PCmas-/-）小鼠模型构建
将Podocin（Nphs2）启动子[19]下表达Cre重组酶的小鼠品系与Cmasfloxed小鼠（携带Cmas外显子4floxed等位基因，编码蛋白活性位点）杂交，产生足细胞特异性CMAS敲除（PCmas-/-）的小鼠[17,18,24,25]（图1A）。利用PCR对突变型和野生型等位基因进行鉴定（图1B）。
PCmas-/-小鼠发生进行性蛋白尿且死于肾功能衰竭
各种基因型小鼠均按照预期的孟德尔定律出生。从出生到出生后3周，PCmas-/-小鼠与对照组同窝小鼠无显著外观差异，但从出生后28天开始出现生长延缓和体重减轻（图1，C和D）。突变小鼠在出生后6到8周内死亡。PCmas-/-小鼠出生后28天左右开始出现蛋白尿，一过性症状随时间加重（图2A）。PCmas-/-小鼠的尿蛋白与肌酐比值在出生后21天之前与野生型小鼠相同，在出生后第42天升高至野生型小鼠的30倍（图2B）。PCmas-/-小鼠的GFR在出生后21天处于正常水平，而在出生后28天显著降低，表明过滤单元受损（图2C）。杂合子小鼠通常不受影响（图2，A和B）。
PCmas-/-小鼠发生FSGS样改变
光学显微镜下，肾脏切片苏木精-伊红染色显示，出生21天时，不同基因型小鼠的肾脏组织学和超微结构并无显著差异（图3，A和B）。在出生28天时，PCmas-/-小鼠肾小球与野生型没有区别，仅在一些近曲小管和远曲小管管腔中出现嗜酸性物质（图3A）。从超微结构上看，PCmas-/-小鼠在出生后28天时，足细胞FP脱落伴随发育完整的SD减少，从而导致在出生后第42天时FP融合、SD消失，微绒毛形成（图3B）。有意思的是，PCmas-/-小鼠的内皮细胞窗孔和GBM形态在上述各时间点相较野生型小鼠无显著改变（图3B）。光学显微镜下，42天时，与野生型小鼠相比，PCmas-/-小鼠肾脏PAS（过碘酸-雪夫染色）和偶氮卡红染色显示肾小球系膜基质扩张（图4，A和B）、胶原沉积增加（图4B）、系膜细胞增加（图4A）。利用α-平滑肌肌动蛋白染色证实突变小鼠肾小球系膜细胞活化，α平滑肌肌动蛋白染色不但在血管平滑肌细胞中呈阳性，在肾小球毛细血管丛（57天）和鲍曼氏囊中也呈阳性（42天和57天）（图4C）。出生后42天时，PCmas-/-小鼠的肾小球毛细血管丛与鲍曼氏囊发生多灶性粘连并完全融合（图4B），且二者发生扩张，伴有肾小球毛细血管腔狭窄（补充材料图2）。上述形态学改变在出生后42天时最为显著（图3和4）。然而，尽管部分肾小球受损严重，但其他肾小球未显示任何病理迹象。综上，PCmas-/-小鼠的组织学肾脏表型与人类FSGS极为相似。
为探讨足细胞表面的唾液酸缺失是否会导致足细胞耗竭，我们分析了出生后42天肾脏切片中足细胞标记蛋白突触足蛋白和肾母细胞瘤蛋白1（Wilmstumorprotein，WT1）的表达水平，并对WT1-阳性细胞进行了量化（图4D）。野生型小鼠中突触足蛋白仅在脏层上皮细胞表达，但PCmas-/-小鼠突触足蛋白除在脏层上皮细胞表达外，还在部分鲍曼氏囊壁上皮细胞中表达。然而，对肾小球毛细血管丛的WT1-阳性细胞进行计数后发现，PCmas-/-小鼠中平均肾小球足细胞数量显著低于对照组小鼠（图4E）。
唾液酸化缺失导致PCmas-/-小鼠发生蛋白尿
我们通过黑接骨木凝集素（Sambucusnigralectin,SNA）染色细胞表面唾液酸化作用监测CMAS在功能水平上的丢失，尤其以α-2,6-连接的唾液酸为主（图5A）。通过利用唾液酸苷酶处理去除唾液酸后进行外源凝集素特异性染色。在出生后21天，各种基因型小鼠肾小球均出现高度唾液酸化，而PCmas-/-小鼠出生28天后出现足细胞唾液酸丢失，在出生后42天时上述表现最为显著。有趣的是，在出生后28天，PCmas-/-小鼠的肾小球皮质近髓质处已经出现足细胞唾液酸化缺陷，而在被膜下区域的足细胞仍然保持唾液酸化（补充材料图3）。由于糖脂蛋白在进行石蜡包埋切片过程中经常丢失，唾液酸化糖蛋白主要以SNA染色来确定（图5A）。通过监测保留脂质的冰冻肾脏切片中的双唾液酸神经节苷脂CD60b[26,27]表达来研究糖脂蛋白的唾液酸化作用（图5B）。与足糖萼蛋白共染后发现，在野生型小鼠中，不同时段均存在双唾液酸神经节苷脂表达，而在出生后28天的PCmas-/-小鼠肾小球中这些表位明显丢失，这与SNA染色结果一致（图5A）。接下来我们分析了两种唾液酸糖蛋白（即SD基质蛋白和粘蛋白足萼糖蛋白）的唾液酸化状态，它们在Cmashls小鼠肾脏表型发育中具有重要作用[14]（图5C）。与免疫组化结果一致，对PCmas-/-小鼠肾脏裂解液中肾病蛋白唾液酸化的延时分析发现，在出生后28天开始，唾液酸化开始减少，而在出生后21天即开始出现足糖萼蛋白的低唾液酸化现象（图5C，下面的横行）。与观察到的足细胞丢失一致，在出生42天的突变小鼠中，肾病蛋白和足糖萼蛋白的表达量减少（图5C和6A）。足糖萼蛋白在出生后42天的PCmas-/-小鼠细胞表面正常定位尽管唾液酸化显著降低，肾病蛋白在出生后28天的PCmas-/-肾小球中定位模式发生改变，在出生后42天时表达显著降低（图6A）。
PCmas-/-小鼠去唾液酸化肾病蛋白与其他SD蛋白定位发生异常
由于肾病综合征患者肾活检标本[28-31]中以及肾病综合征动物模型[32-35]中均会出现肾病蛋白定位异常，且转运缺陷与肾脏疾病发展相关[36,37]，因此我们利用间接免疫荧光与其他细胞室标记蛋白共染来探究肾病蛋白的细胞内轨迹（补充材料图4）。与野生型小鼠相比，通过分泌通路（穿膜蛋白和VEGF）标记物发现共定位增强，同时还发现内吞标记物网格蛋白增加（补充图4，B-D），但小窝蛋白与早期核内体、溶酶体表达不增加（补充图4，E-G）。由于免疫荧光分析无法反映肾病蛋白的动态变化，我们分别利用具有唾液酸化能力的野生型和去唾液酸化的CMAS-/-HEK细胞来探讨这一现象（补充材料图5）。然而，在这些细胞模型中，肾病蛋白细胞表面表达和内作用均无差异，从而强调了在复合组中研究这些过程的重要性，因为转运可能取决于细胞类型及多种其他因素，最重要的是肾小球细胞与周围环境的相互作用。接下来，我们观察了其他SD成分的定位情况。在出生28天的PCmas-/-小鼠中，我们发现NEPH1、膜蛋白和胞质紧密粘连蛋白1（zonulaoccludens-1,ZO-1）在去唾液酸化的肾病蛋白发生定位异常后与肾病蛋白共定位，提示突变小鼠中其他SD蛋白的定位也受到影响（图6B）。
体外实验证实唾液酸化对足细胞发育和粘附至关重要
为探讨体外条件下唾液酸化对足细胞稳态的作用，我们从永生化PCmas-/-小鼠（imPCmas-/-小鼠）肾小球中分离并建立了原始Cmas-敲除足细胞。结果显示，imPCmas-/-小鼠肾脏表型与PCmas-/-小鼠一致（补充材料图6）。从PCmas-/-小鼠和对照组小鼠肾小球中生长而来的细胞岛显示出鹅卵石样外形，并表达足细胞标记物WT1和突触蛋白（补充材料图7A）。然而，在所有基因型小鼠中分离出来的足细胞克隆中，仅发现Cmasfloxed等位基因，未发现Cmas敲除等位基因（补充材料图7B）。尽管细胞分离后我们能即刻确定PCmas-/-小鼠肾小球中存在Cmas敲除等位基因，（补充材料图7C），但利用不同生长时期（P24-P34）转基因小鼠进行一系列独立实验，共分析个克隆细胞，未能在PCmas-/-小鼠的肾小球产物中发现Cmas-阴性足细胞细胞系。
在接下来的实验中，我们在永生化野生型足细胞中应用CRISPR/Cas9技术获得三个独立的CMAS-敲除克隆细胞系。通过靶向基因组位点（补充材料图8）测序分析与足细胞裂解液中CMAS蛋白的缺失（图7A）显示基因敲除成功。在不同的基因组中，所有细胞系均表达足细胞标记物WT1，其细胞体外分化能力由细胞形态学和突触极蛋白表达确定（图7B）。3天内的细胞增殖分析未显示去唾液酸化足细胞与野生型足细胞的显著差异（图7C）。由于唾液酸定位于细胞表面的最外层，而足细胞基质的粘附对于维持肾小球滤过屏障至关重要，我们还分析了细胞表面唾液酸化作用缺失是否影响体外足细胞对GBM主要成分（Ⅳ型胶原和层粘连蛋白）的粘附效果。我们发现与野生型足细胞相比，CMAS-敲除足细胞向胶原粘附的特性显著下降这一重要结果（图7D）。与此不同的是，其向层粘连蛋白的粘附性没有变化（补充材料图9）。如预期所示，我们还发现在PCmas-/-足细胞中，β1-整合素蛋白的唾液酸水平显著下降（图7E；通过蛋白质印迹的质量位移显示），后者是整合素蛋白受体异质二聚体的主要结构，介导足细胞-GBM相互作用。此外，成熟型β1-整合素蛋白糖型[38]表达水平下降，提示唾液酸化对于β1-整合素蛋白在足细胞中的稳态、转化和功能至关重要。
讨论
为明确解析唾液酸化聚糖在体内对足细胞的作用，我们建立了一个足细胞特异性唾液酸化缺失动物模型。尽管能在PCmas-/-小鼠的肾小球毛细血管袢形成早期（胚胎期13.5天至出生后7天）的未成熟足细胞中观察到最初膜蛋白启动子编码的Cre表达[19]，但在出生21天后便开始出现唾液酸化缺失，并在随后1周内开始出现蛋白尿，继而在出生后60天发生肾功能衰竭（图8）。与预期不同，PCmas-/-小鼠出现疾病表型和死亡发生较晚，可能与CMAS蛋白的长半衰期以及足细胞表面蛋白的半衰期有关。近期一项研究为我们这种推测提供了依据，在体内实验中，通过在成熟肾小球中诱导去除足细胞特异性肾病蛋白以评估其半衰期，结果显示大约为3周[39]。通过对出生后21-42天分离的组织切片进行延时分析发现，PCmas-/-小鼠足细胞表面唾液酸化的缺失会产生一系列后续反应：第一，我们观察到足细胞FP消融和应激改变，这些改变与微小病变类似，伴有后续损伤的足细胞脱落和丢失。曾报道在一些人类的肾小球疾病以及肾脏疾病的模型中发现足细胞尿，其与疾病进展有关[40-42]。PCmas-/-小鼠中初始足细胞缺陷会激发继发性损伤，主要表现为肾小球系膜细胞显著活化[43]和肾小球毛细血管损伤[44,45]，导致出现一些与人类FSGS相似的表型特征。我们还注意到肾小球顶部的上皮细胞活化导致粘连形成，该反应是对足细胞数量减少的一种代偿性机制[46,47]。我们的研究数据提示微小病变和FSGS可能是一种疾病不同阶段的表现，Mass及其同事也有类似的报道[48]。在PCmas-/-小鼠中，肾病蛋白的分布随着时间发生变化：从唾液酸化肾病蛋白毛细血管袢模式到去唾液酸化肾病蛋白颗粒样模式，到最后肾病蛋白表达显著降低。由于唾液酸化聚糖能调节糖蛋白的转运[49]，我们利用PCmas-/-小鼠模型来分析病理状态下肾病蛋白细胞内轨迹。分泌性和内吞性小体通路内的去唾液酸化肾病蛋白分布增强但零散，提示肾病蛋白发生不完全糖基化改变。然而，我们还观察到肾病蛋白与其他SD蛋白发生共定位，提示这种定位错误可能参与了足突细胞FP表型的改变。在人肾活检标本中出现的肾病蛋白定位错误是否反映出现足突细胞的转化和足突外形的改变，仍需要进一步探讨。与肾病蛋白不同，PCmas-/-小鼠中足糖萼蛋白没有出现定位错误，证实了之前的报道，即在经过唾液酸酶或PAN处理后，足细胞表面顶部的足糖萼蛋白没有变化[50]。然而，Farquhar及其同事之前报道，大鼠进行唾液酸酶处理后足糖萼蛋白与细胞骨架肌动蛋白发生解偶联[51]，这种机制可能也参与了PCmas-/-小鼠FP的消融。此外，虽然与激素敏感型肾病综合征的相关性高于激素抵抗型肾病综合征，可溶性足细胞糖蛋白血管紧张素样-4的低唾液酸化也可诱导发生蛋白尿，因此也可能参与了PCmas-/-小鼠模型中疾病的发生[52,53]。尽管在PCmas-/-小鼠中所有细胞表面的糖缀合物均缺乏唾液酸化，似乎有理由推测PCmas-/-小鼠的表型有多种因素参与。对成功传代的永生化去唾液酸化足细胞系进行生化分析显示，唾液酸化本身在体外对于足细胞的多样性、增殖或分化都不具有必要性。我们近期还发现其他唾液酸化缺陷细胞系（包括多能骨髓干细胞）具有多样性、增殖和分化至三种胚芽及跳动心肌细胞的能力，从而支持上述的判断[17]。去唾液酸化足细胞对Ⅳ型胶原结合能力的下降也证实在PCmas-/-小鼠中，唾液酸化对足细胞向GBM的粘附性至关重要，可能参与PCmas-/-小鼠肾小球生成过程中出现的唾液酸化足细胞缺失。在人类结肠癌中，足细胞唾液酸化依赖性粘附至Ⅳ型胶原而非层粘连蛋白，而在人乳腺癌发病中就不存在这种变化[54,55]，提示细胞类型特异性的特征。尽管足细胞表达大量不同的细胞基质粘附受体，其中包括α营养不良聚糖蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，但向Ⅳ型胶原和层粘连蛋白的粘附主要由整合蛋白家族介导，主要是大量的α3，β1-整合蛋白（主要与层粘连蛋白结合）和α1，β1-整合蛋白（主要与Ⅳ型胶原结合）[56]。去唾液酸化足细胞中出现的β1-整合蛋白表达水平的降低，再结合实验中发现的去唾液酸化后出现的β1-整合蛋白的构象变化[57]，提示唾液酸化对整合蛋白异二聚体的组装、聚集、激活及其与其他跨膜蛋白（例如跨膜四蛋白）的整合至关重要。整合蛋白基因突变患者[58,59]以及整合蛋白组装或信号转导异常小鼠模型中均出现FSGS，进一步凸显了足细胞向GBM粘附缺陷在FSGS进展中的重要作用[60-62]。此外，最近很多研究指出编码糖基化通路酶的基因缺陷与肾病综合征的发病有关[63-65]。后期研究剖析了多种糖基化修饰过程中单一复合物对肾小球滤过的独特作用。然而，只有30%的遗传性和10%-20%的散发性激素抵抗型肾脏综合征与基因突变有关，大部分病因至今不明[66,67]。
考虑到人类足细胞的高度唾液酸化[68]，一些报道也指出在出现蛋白尿的肾病综合征患者中存在肾小球唾液酸化降低[69]，我们的实验数据支持唾液酸化缺失可能是FSGS复杂发病机制中的一部分。所以，我们猜测，用于诊断激素抵抗型肾病综合征的下一代测序可能会发现那些参与唾液酸化或其他糖基化通路的基因突变。此外，如在膜性肾小球疾病[70]、感染（消耗唾液酸酶的微生物）[72]和药物治疗中[71]所观察到的，基因异常会影响细胞表面唾液酸的表达，导致内源性肾小球唾液酸化酶表达增加。因此，利用唾液酸特异性凝集素染色，对病因不明的特发性肾病综合征患者的肾活检标本进行唾液酸化模式分析，会成为一个新的诊断方法。为了排除唾液酸化在人类肾小球功能中的物种特异性，目前已有开始针对生理和病理状态下的人肾活检组织的研究。更为重要的是，对于发生肾功能衰竭和早期出生后死亡的GneMT小鼠，可以通过给予唾液酸或其代谢前体物质N-乙酰甘露糖胺进行治疗[13,73,74]；同时对遗传性包涵体肌病患者，进行唾液酸饮食补充治疗能成功改善其肌肉功能[75]。我们的研究结果提示唾液酸补充治疗可能有助于延缓CKD进展，并降低ESRD患病率。
致谢ACKNOWLEDGMENTS
WewouldliketothankRitaGerardy-SchahnforcontinuoussupportandhelpfuldiscussionsandProf.LawrenceHolzman,UniversityofPennsylvania,Philadelphiaforkindlyprovidingthepodocin-Cremouse.KerstinFl?chsig-SchulzandUlrikeBernardareacknowledgedforexperttechnicalassistance.
Mr.WedekindreceivedascholarshipfromtheGermanAcademicScholarshipFoundationandMs.SchmitzandDr.Br?senreceivedfundingfromtheDr.WernerJackst?dtFoundation.ThisworkwassupportedbyfundsfromtheGermanResearchFoundationtoDr.WeinholdandDr.Münster-Kühnel(WE/1-1andMU/2-1).
Dr.WeinholdandDr.Münster-Kühneldesignedthestudy;Ms.Niculovic,Dr.Blume,Mr.Wedekind,Ms.Beuke,Ms.Albers,Ms.Kats,andDr.Grooscarriedoutexperiments;Ms.Niculovic,Dr.Blume,Mr.Wedekind,Ms.Beuke,Dr.Melk,Dr.Groos,Dr.Abeln,Ms.Schmitz,Dr.Br?sen,Dr.Schiffer,andDr.Münster-Kühnelanalyzedthedata;Ms.Niculovic,Dr.Blume,Mr.Wedekind,andDr.Weinholdmadethefifigures;Ms.Niculovic,Mr.Wedekind,Dr.Weinhold,andDr.Münster-Kühneldraftedandrevisedthepaper;allauthorsapprovedthefifinalversionofthemanuscript.利益披露DISCLOSURES
无。
补充材料SUPPLEMENTALMATERIAL
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