Hellow艾瑞波dei，好久不更新原创文章了，最近天气突然变冷了，打字手都冻得慌！

今天给大家带来的是由惘闻老师原创的，关于“支原体检测法-培养法和qPcr法对比”的文章，欢迎大家转发分享，支持原创！

另外特别鸣谢赛多利斯公司对本文的支持，文末有福利，大家可以免费申请试用其最新支原体检测试剂盒哦！

支原体检测法详解-培养法和qPCR法对比

作者：惘闻

编辑：兔兔子

来源：实验助手app

特别鸣谢：赛多利斯（Sartorius）

01

支原体检测方法概述

在细胞领域，支原体污染是世界性难题。据统计，在传代细胞培养过程中，支原体的污染率约达到15-35%的比例。支原体的侵染会导致细胞染色体的异常和损伤，并持续造成危害。支原体污染会严重影响实验结果，故对其的检测非常重要。

支原体检测方法有很多，培养法、DNA荧光染色法、ELISA法、PCR法等等。中国药典列出的支原体标准检测方法有两种：培养法和指示细胞培养法。培养法即接种待检样品于培养基上通过培养，在倒置显微镜下观察培养基上有无“荷包蛋”状菌落。培养法方法简单，灵敏度高，假阳性率低，但耗时长达20天左右。

02

培养法及其实验操作过程详解

支原体分离培养法，顾名思义，是从可疑的细胞培养体系中取样，并接种到最适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长，最终形成明显可见的特征性菌落。需要注意的是，培养法尽管可以检测绝大多数支原体种类，但个别支原体仍无法检测到。

1试验试剂

口腔支原体（ATCC）或肺炎支原体（ATCC）、75%无菌酒精、支原体肉汤培养基、精氨酸支原体肉汤培养基、支原体半流体培养基、支原体琼脂培养基

2试验器材和设备

个人防护设备（无菌手套，洁净服等）、生物安全柜、CO2培养箱、厌氧罐、倒置显微镜（放大倍数：10×10）

3操作步骤

1.取0.2ml待检样品接种到2块支原体琼脂培养基平板。

2.取cfu的口腔支原体或肺炎支原体接种2块琼脂培养基平板，作为阳性对照。

3.取未接种的2块琼脂平板作为阴性对照。

4.取供试品0.5-1.0ml，接种于支原体液体培养基中，置36℃±1℃培养21天。

5.取cfu的口腔支原体或肺炎支原体接种于肉汤，作为阳性对照。

6.取未接种的2管肉汤培养基，作为阴性对照。

7.于接种后的第7天从4支支原体液体培养基中各取2支进行代次培养，每支培养基分别转种至相应的支原体琼脂培养基及支原体液体培养基各2支，置36℃±1℃培养21天，每隔3天观察1次。

8.置36℃±1℃培养7～14天，观察培养基变色结果。使用倒置显微镜在x放大倍数下观察培养后的琼脂平板以检测支原体菌落的存在。

9.镜检观察时，在同一视野下应注意区分气泡、支原体菌落或者细胞残渣。支原体菌落成煎蛋状；两个可见的圆圈，一个在另一个里面。气泡虽然也是圆圈，但是并不凸起，且在特定角度下，中间可透光。如下对比图。

图2支原体

4结果判定

培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。

03

PCR法及其介绍

虽然培养法被喻为支原体检测的“金标准”，但在支原体分离培养的过程中，要长出明显的克隆至少需要4周的时间。对于有效期较短的产品，诸如Car-T、细胞治疗以及基因治疗等，28天的检测时间显然过于漫长，无法满足其快速检测放行的需求。因此，如何能够快速、准确的进行支原体检测，势必成为这类企业







































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