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会议大咖司端运天津药物研究院研究员，释药技术与药代动力学国家重点实验室常务副主任，中国药理学会药物代谢专业委员会秘书长，CFDA新药审评专家，天津市安全评价研究中心党支部书记、副总经理。中国药学会系列期刊《药物评价研究》副主编等。年被评为天津市优秀留学回国人员，年被授予天津市劳动模范光荣称号，年被中国科协评为全国优秀科技工作者。DBS法与传统采样法用于人体药物代谢动力学试验的比较研究干血点采样（DBS），是将全血样品点在特制卡纸上的一种生物样品采集新技术，比传统方法具有很多优势，并可节省大量研究经费[1]。DBS法与液质联用技术在药物定量分析中已成为一个重要方法，但还不够完善[2-3]。本试验采用DBS法与传统静脉血浆采样法同时取样，比较分析热毒宁注射液中栀子类成分，在健康人体内的药时曲线和药代参数，从而为DBS法的推广应用提供参考。1材料1．1药品与试剂热毒宁注射液：每支10mL，江苏康缘药业股份有限公司生产，生产批号。栀子苷：含量99．7％，中检所，批号－，山栀苷：含量98．36％，中检所，批号，京尼平龙胆双糖苷：含量98．25％，中检所，批号，桃叶珊瑚苷（内标）：含量99．5％，中检所，批号－。甲醇、乙腈均为色谱纯。1.2仪器美国ABSciex公司，API型液相色谱－三级四极杆质谱联用仪，配有电喷雾离子源（ESI）；日本Shimadzu公司液相色谱系统。梅特勒－托利多公司XS－型分析天平。美国Thermo电子公司17R型冷冻离心机。美国Zymark公司TurboVapLV型样品浓缩仪。北京踏锦科技有限公司VX－Ⅱ型TarginTech多管涡旋振荡器。2试验方法2.1受试者的选择纳入标准[4]：1）健康志愿者，男女各半。2）年龄：18～40岁。3）体重指数在19~24范围内[体重指数=体质量（kg）/身高2（m2）]，且男性体质量60～70kg、女性体质量50～60kg。4）体格检查及理化检验指标均在正常范围。5）志愿签暑知情同意书。排除标准：1）3个月内用过已知对人体脏器有损害的药物。2）近1周内正在应用其他预防或治疗药物者。3）最近3个月献血者及试验采血者。4）怀疑或确有酒精、药物滥用史。5）妊娠期、哺乳期及准备妊娠妇女。6）法律规定的残疾患者。7）根据研究者判断，不宜参加试验者。16位健康受试者，经全面体检，血尿便常规、肝肾功能、心电图以及血液分析正常，符合试验要求。受试者于试验期间食用统一标准餐，试验期间不得饮用碳酸饮料、咖啡、茶叶水等，避免剧烈运动。2.2给药方法及样本采集受试者于试验前1d晚入住Ⅰ期临床试验病房，禁食过夜10h以上，次日晨起进食标准清淡早餐，8∶00时静脉输注热毒宁注射液20mL，以20％葡萄糖注射液稀释至mL。使用输液泵控制恒速滴注90min完毕，滴速为3mL/min。选择静脉输注给药前，静脉输注过程中0．5、1、1．5h，静脉输停药后15、30、45min、1、1．25、1．5、2、3、4、6、8、12、24h从志愿者肘静脉取血，每次3mL。2.3血样及样品处理志愿者肘静脉取血3mL至肝素采血管，上下摇匀，吸取40μL全血点卡2份（双样本，卡片放于室温下2h内自然晾干，然后装入已加有干燥剂的封口袋中于4℃密封保存）。剩余全血以r/min离心10min，分离血浆，吸1份50μL于EP管中，再将剩余的血浆全部转移到另一EP管中，血浆样品直接冻入-80℃冰箱保存。吸取50μL血浆或空白血浆，50μL甲醇或50μL栀子3种成分系列混合标准工作液/QC工作液，μL内标桃叶珊瑚苷（2μg/mL）甲醇溶液，涡旋1min，4℃r/min离心10min。取上清液μL加50μL去离子水，涡旋1min，吸取μL至内插管，进样10μL进行LC－MS/MS定量分析。从全血点卡上，用打孔器打6mm全血纸片至2mLEP管中，加入μL内标桃叶珊瑚苷（ng/mL，甲醇∶水＝70∶30配制）溶液，超声30min，吸取上清液μL，40℃氮气吹干，用μL复溶溶液（甲醇∶水＝50∶50）涡旋1min复溶4℃r/min离心5min，进样10μL进行LC－MS/MS定量分析。精密称取栀子苷标准品、山栀苷标准品和京尼平龙胆二糖苷标准品5.00、4.99、5.00mg，分别置于3个5mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，分别获得1mg/mL的栀子苷、山栀苷、京尼平龙胆二糖苷3种标准品储备液[6]。用甲醇配制栀子5种待测成分的混合标准贮备液，随后用甲醇梯度稀释成浓度为0．01/0．（栀子苷浓度为0.01μg/mL，山栀苷、京尼平龙胆二糖苷浓度均为0.μg/mL，以下同此0.02/0.01、0.1/0.05、0.5/0.25、2/1、10/5、25/12.5μg/mL的栀子3种成分混合标准系列工作液。精密称取桃叶珊瑚苷（内标）标准品4．46mg于10mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得桃叶珊瑚苷浓度为μg/mL的标准贮备液，并进一步用甲醇稀释为2μg/mL的标准工作溶液。所有溶液置于4℃保存备用。应用LC-MS/MS方法测定人血浆中栀子苷、山栀苷以及京尼平龙胆双糖苷的含量。人血浆中栀子苷定量分析的线性范围为0.01~25μg/ml，LLOQ为0.01μg/mL，人血浆中山栀苷和京尼平龙胆双糖苷定量分析的线性范围为0.~12.5μg/mL，LLOQ为0.μg/mL。在低、中、高3个浓度水平下批内精密度（RSD）小于5.38%，批间精密度（RSD）小于8.30%，准确度（RE）在0.5%~7.4%之间。栀子苷等成分的基质效应在96.5%~.0%之间，回收率在94.7%~98.8%之间。应用LC-MS/MS方法测定DBS样品中栀子苷、山栀苷以及京尼平龙胆双糖苷的含量。DBS样品中栀子苷定量分析的线性范围为0.02~25μg/mL，LLOQ为0.02μg/mL，DBS样品中山栀苷和京尼平龙胆双糖苷定量分析的线性范围为0.01~12.5μg/mL，LLOQ为0.01μg/mL。在低、中、高3个浓度水平下批内精密度（RSD）小于5.00%，批间精密度（RSD）小于11.8%，准确度（RE）在3.0%~12.0%之间。栀子苷等成分的基质效应在93.5%~.0%之间，回收率在97.1%~.0%之间。2.4测定栀子苷等成分的色谱与质谱条件色谱柱：EcosilC18（mm×4.6mm）。流动相：A甲醇，B20mmol/L甲酸铵，0.1%甲酸，10%甲醇。梯度：0min~7min，85%B→60%B；7min~9min，60%B→20%B；9min~11min，20%B→20%B；11min~11.1min，20%B→85%B；11.1min~15min，85%B。流速：0.5mL/min，保留时间：桃叶珊瑚苷4.53min，山栀苷5.44min，京尼平龙胆二糖苷8.01min，栀子苷9.68min。卷帘气：14psi，碰撞气：8psi，喷雾电压：V，源温度：℃Gas1：80psi，Gas2：40psi，入口电压10V，碰撞出口电压：10V，质谱运行采集时间：11min。2.5数据处理根据试验中测得的各受试者的血药浓度-时间数据绘制各受试者的药-时曲线及平均药-时曲线，进行药物代谢动力学参数的估算求得药物的主要药物代谢动力学参数[7]，包括：达峰时间（Tmax，实测值）、峰浓度（Cmax，实测值）、平均浓度-时间曲线下的面积（AUC0-t）、药时曲线下总面积（AUC0-）、表观分布容积（Vd）半衰期（t1/2）、平均驻留时间（MRT0-t）、总清除率（CL）等，采用WinNonlin6.3软件进行分析，并对计量资料进行配对t检验分析。3结果3.1栀子苷、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷人血浆和DBS法血药浓度比较见表1。3.2栀子苷、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷人血浆和DBS法药代参数比较见表2。4讨论热毒宁注射液由青篙、金银花、桅子组成，具有69清热、疏风、解毒之功，用于外感风热所致的高热、微恶风寒、头痛身痛、咳嗽等症，是治疗上呼吸道感染的纯中药注射剂，其中栀子苷与绿原酸做为质量检测指标[8]。但其中绿原酸类成分由于在空气中易于氧化、不稳定，无法用于DBS法的含量检测，故仅选择栀子苷类成份进行比较分析。中药药物代谢动力学研究，较化学药物的研究更为困难，一直是研究的热点和重点问题[9]。液相色谱串联质谱联用，使得分析速度快、选择性好、简便、精确、灵敏度高的特点，适用于多组分药物代谢动力学研究[10]。健康受试者单次静脉滴注热毒宁注射液，DBS法测定3种栀子成分的全血浓度经血细胞比容校正后，栀子苷、山栀苷、京尼平龙胆双糖苷的Tmax分别为1.41、1.47、1.47h；Cmax别为4.58、0.、0.μg/mL；AUC0-t分别为9.06、0.、1.20（μg·h）/mL；MRT0-t分别为1.52、1.49、1.45h；CL分别为2.06、32.3、17.2L/h；Vd分别为11.7、51.9、29.3L；t1/2分别为3.98、1.13、1.20h。与文献报导的动物试验结果有差异[11-14]。山栀苷、京尼平龙胆双糖苷血浆法和DBS法（校正后）计算的血药浓度和药代参数较为一致，栀子苷的血药浓度数据从给药结束后1h起开始出现差异，从3.1可以看出，DBS法测定的血药浓度要高于血浆法的测定结果，从药时曲线上看，DBS栀子苷的消除下降趋势变缓，因此导致t1/2、AUC0-t、MRT0-t均明显高于血浆法的计算结果，产生这一结果的原因还需要进一步的研究。本文为司端运老师于年2月份发表在《天津中医药》的文章，年12月3日在“医药江湖，渤海之约｜医药研发年会”上，我们将有幸继续聆听司端运老师就“药物代谢动力学研究在新药成药性评价中的作用”的专题解读！年12月3-4日，司端运老师与您不见不散！