白癜风的治疗药物 http://disease.39.net/bjzkbdfyy/170816/5629059.html

摘要：目的基于细胞代谢组学的方法研究水栀子Gardeniajasminoside及其主要有效成分京尼平苷对RBL-2H3细胞脱颗粒模型的干预作用。方法利用UPLC-QTOF-MS高分辨质谱检测RBL-2H3细胞的代谢轮廓改变，并应用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）筛选出引起这种差异的代谢标志物；同时应用MEV软件对差异标志物水平的变化进行聚类分析和热图绘制。结果分别得到与水栀子和京尼平苷作用相关的代谢标志物54和46个，其中共有标志物31个，且在2个给药组中变化趋势相同。由共有代谢标志物富集得到了受干扰的5条代谢通路：甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢，谷胱甘肽代谢，组胺代谢，能量代谢，烟酰胺代谢。结论水栀子和京尼平苷通过调节组胺代谢、氧化应激和能量代谢而抑制RBL-2H3细胞脱颗粒过程，且京尼平苷是水栀子发挥作用的主要药效物质基础之一。

过敏反应又被称为变态反应，是指外源性抗原物质与机体抗体接触时免疫系统发生的一种过度反应，通常被认为是免疫系统的紊乱[1-3]。其反应机制主要有免疫球蛋白E（IgE）介导的I型过敏反应和不依赖IgE参与的辅助型T淋巴细胞1（Th1）、辅助型T淋巴细胞2（Th2）之间的免疫失衡2种形式[4]。其中I型过敏反应在临床中最为多见，其发生过程主要是由过敏原进入机体后可诱导B细胞产生IgE抗体，而肥大细胞表面的IgE受体与之结合，使机体处于致敏的状态，当再次接触致敏原时可触发肥大细胞脱颗粒反应，其脱颗粒程度与变态反应的强度呈正相关的变化趋势[5]。

水栀子为茜草科植物水栀子GardeniajasminosideEllis.var.radicans(Thunb.)Makino的干燥成熟果实，主产于江西、湖南、湖北等地，具有解热、镇静止痛和疏风解湿的功效。现代研究表明，水栀子具有抗氧化、降血糖和神经保护等作用[6-7]，主要化学成分有栀子油、环烯醚萜苷、萜类、黄酮类、有机酸类、多糖类等成分[8-9]，以环烯醚萜苷类中的京尼平苷含量最高[6]。本课题组在前期活性筛选中发现，水栀子和京尼平苷均具有良好的抗过敏活性，而肥大细胞作为过敏反应中的受体细胞，能直接反映在过敏原刺激下的代谢状态变化[10]，且大鼠嗜碱性细胞白血病粒细胞系RBL-2H3具有肥大细胞的多种生物学特性，是体外研究肥大细胞功能的重要工具[11]。因此，本实验采用细胞代谢组学[12]的研究方法，基于RBL-2H3细胞脱颗粒模型探讨水栀子和京尼平苷对细胞内代谢的干预作用，从而进一步阐释水栀子抗过敏作用的相关机制和物质基础。

1材料

1.1药材与试剂

水栀子购自河南省唐河县，经河南中医药大学陈随清教授鉴定为茜草科栀子属植物水栀子GardeniajasminosideEllis.var.radican(Thunb.)Makino的干燥成熟果实。C48/80（4-硝基苯基-N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷，Sigma公司）；DMEM培养基（Gibco公司）；台氏液（BBS，北京索莱宝科技有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程研究所）；胰酶（Biosharp公司）；青霉素/链霉素（北京索莱宝科技有限公司）；京尼平苷由本实验室从水栀子中分离得到，其质量分数大于95%；甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，美国FisherScientific公司）；纯净水（娃哈哈集团有限公司）。

1.2细胞

RBL-2H3细胞购自中国科学院细胞库。

1.3仪器

CO2培养箱（美国ThermoScientific公司）；maXisHD四极杆-飞行时间质谱（德国Bruker公司）；DionexUltimate超高效液相色谱仪（美国ThermoScientific公司）；R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

2方法

2.1水栀子水提物的制备

取水栀子适量，10倍量水煎煮3次，每次1h，滤过合并滤液，减压冷冻干燥，称质量，提取率为22.7%，得到水栀子提取物（含京尼平苷15.81%）[13]。

2.2细胞培养、分组及给药

用含有15%胎牛血清、青霉素66.7mg/L、链霉素mg/L的DMEM完全培养基于5%CO2、37℃的饱和湿度培养箱中培养RBL-2H3细胞，取对数生长期细胞接种于培养皿中，培养24h，细胞数量达到80%以上（2×个/mL）后，设置对照组、模型组、水栀子水提物（水栀子）组和京尼平苷组，每组平行培养8份。对照组给予相同体积的台氏液；模型组给予含有20μg/mLC48/80的台氏液[14]；水栀子组给予含有20μg/mLC48/80和10μg/mL（基于前期对水栀子和京尼平苷最佳质量浓度的筛选确定）水栀子水提物的台氏液；京尼平苷组给予含有20μg/mLC48/80和10μmol/L京尼平苷的台氏液，4组细胞均放入培养箱中孵育30min后进行样本的制备。

2.3细胞样本的制备

在细胞培养箱中孵育30min后，移去细胞上清液，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，?20℃预冷20min）洗涤2次，向每皿中加入0.05%的胰蛋白酶溶液1mL收集细胞，2～3min后加入2mL的培养液终止胰酶的消化，在预冷转子的离心机中r/min、4℃离心6min，移去上清液，加入?20℃的甲醇-水（4∶1）1mL，然后将细胞在冰浴中超声破碎处理10min，随后在1r/min、4℃离心10min。收集上清液并用N2吹干，将残余物用乙腈-水（1∶1）复溶，再次1r/min、4℃离心10min，将上清液转移至进样瓶中供LC-MS分析[12]。质控样本（QC）是从所有样本中分别取40μL混合到进样瓶中制备得到。在进序列前先连续进QC样本6次，以检测仪器的稳定性。

2.4检测条件

2.4.1色谱条件ThermoAcclaimTMRSLCC18色谱柱（mm×2.1mm，2.2μm）；体积流量0.3mL/min；进样体积2μL；柱温40℃；流动相A为0.1%甲酸-水溶液、B为乙腈，梯度洗脱条件：0～7min，98%～85%A；7～19min，85%～72%A；19～20min，72%～2%A。

2.4.2质谱条件质谱离子源为电喷雾（ESI）离子源，正、负离子检测模式；毛细管电压为V（ESI+）和V（ESI?），雾化器压力为kPa；去溶剂气体流量为8L/min，温度为℃，质量扫描范围m/z～。

2.5数据处理

将仪器采集的谱图信息通过Bruker质谱软件（DataAnalysis4.2、ProfileAnalysis2.1）对原始质谱数据进行数据的校正、滤噪、峰对齐以及归一化等处理，并将质谱数据转化得到的二维矩阵列表再导入SIMCA13.0软件中进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。根据VIP值（VIP＞3.5）和S-plot图筛选对照组和模型组的差异代谢物，并利用SPSS19.0软件对差异代谢物进行t检验统计学分析。并采用MEV4.9.0软件对筛选的差异代谢物水平进行热图绘制和聚类分析。最后通过MetaboAnalyst（