点击上面蓝字↑↑↑ 　　我们常会见到销售过来推荐自家支原体检测试剂盒，即使是基于普通PCR原理检测的国产试剂盒也动辄好几十元一次反应，lonza的检测试剂盒更要元以上一个检测样本。也常会看到有报道提及支原体污染的弊端，甚至有数据说现在二代测序样本中有不少样本数据受到支原体核酸污染干扰结论的准确辨别。之前小编在一家公司花大价钱包的病毒因为携带支原体，耽误了一两个月的实验，最后不得不要来质粒自己包装。

　　言归正传，支原体通常不会大量增值并且不会杀死真核细胞。但它们对真核细胞的各项生物学特性例如增值、凋亡等各方面的影响都非常宽广，常误导我们对于实验结果的判别。对支原体的研究表明，只有7种常见的支原体污染物出现在细胞培养物中。而这7中支原体很难被单一的方法全部检测出，目前提出的一些支原体检测方案例如电子显微镜，生化实验和放射性掺入测定法等，大都操作复杂，不利于成为实验室内部的常规检测。以前支原体的污染主要来源于牛血清，而现在主要来源于在共用实验设备、试剂等过程中的交叉污染。很多人都知道支原体污染的严重性，但是如何在实验室廉价而准确的分析和控制支原体污染呢？小编特地整理了CordC.Uphoff和HansG.Drexler基于PCR的方法检测支原体的经验。

　　聚合酶链反应（PCR）的方法提供了一种快速、灵敏的手段来监测支原体污染，甚至可用于确定污染的物种，这里所描述的方法可以快速完成从样品获取、DNA纯化、PCR反应和分析。

　　PCR法检测中，引物的设计最为关键。目前已有一些引物被公布用于一种或几种支原体污染的检测。多数情况下，支原体16srDNA序列被用做为PCR扩增靶序列，因此其16srRNA也可以被用来进行RT-PCR法检测。而这里，我们介绍了利用混合寡聚核苷酸引物来进行支原体的特异性检测，这一方法比常规单一引物PCR扩增的检测方法相比结果更加可靠，能检出的支原体基本能涵盖常见的7种支原体污染物，并且可以通过限制性内切酶酶切的方法判定支原体污染种类。

图1．图中蓝色小点即显示支原体核酸，图右上为支原体污染细胞，图右下为正常细胞

一、所需材料

1.引物：

5’primers(Myco-5’)

3’primers(Myco-3’)

cgcctgagtagtacgtwcgc

gcggtgtgtacaaracccga

tgcctgrgtagtacattcgc

gcggtgtgtacaaaccccga

crcctgagtagtatgctcgc

r=mixtureofganda

cgcctgggtagtacattcgc

w=mixtureoftanda

2.内对照DNA：

　　含有能扩增比野生型支原体PCR产物长的插入序列的质粒，可从DSMZ(GermanCollectionofMicroorganismsandCellCultures,Braunschweig,Germany)购买。使用前，通过有限稀释法确定PCR反应中能检出的内对照的最低浓度。

3.阳性对照DNA：任何十倍稀释的支原体阳性样品DNA，注意操作时避免交叉污染。

4.TaqpolymeraseMasterMix或者其他taqpolymerase（任意你信得过的产品）

5.可选，限制性内切酶：AspI,HaeIII,HpaII,XbaI

二、操作步骤

1.样品收集之前：待检测的细胞系应在未添加任何抗生素的培养基中连续培养若干天，或者至少在复苏2周之后检测。以使培养基上清中的污染水平达到PCR检测下限。

2.收集细胞培养上清1ml：培养上清中往往混有少量或死或活的真核细胞。以这种方式收集样品，一方面便于一些已侵入或者附着于真核细胞表面的支原体被收集，另一方面也是为了避免收集到过量的真核细胞DNA。收集的待测样本无需离心，可在4℃放置数天或于-20℃放置数周，但一旦解冻应立即进行下一步处理。当用于检测可能受支原体污染的培养基或者添加物时，可以适当增加待检测和处理的初始样本量。

3.收集沉淀：细胞培养悬液13,g离心5分钟，用1mlPBS重悬并涡旋混匀后重新收集沉淀。

4.细胞裂解：ulPBS涡旋混匀，95℃加热15min。

5.纯化待检样本DNA：细胞裂解后，立即用苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀法纯化DNA，其它DNA分离方法提取并纯化DNA。因为未知的Taq酶抑制剂的影响，这里不建议使用一些文献中提到地使用DNA粗制样品用于检测。为方便和快速起见，可以使用商业化试剂盒提取和纯化DNA。

6.PCR反应体系配制和实验设计：

如果你使用预混taq酶的MasterMix配制反应体系

如果你使用单独分装的taq酶配制反应体系

7.添加待检样本DNA：根据实际情况配制如上反应体系，每次检测需额外添加水对照（阴性对照）和阳性且有内对照DNA的对照（阳性对照）。可提前配制预混液后每个PCR管分别添加1ul待检样本DNA。

请注意：

（1）DNA提取、PCR运行、凝胶分析应分区域进行。

（2）所有试剂应小份分装保存以防污染。

（3）避免重复扩增。

（4）储备移液器、PCR管、枪头等仅用于PCR使用，移液器应经常UV照射灭菌。

（5）严格遵守PCR操作规范，避免加样时样本间的交叉污染。

（6）样本制备和PCR操作过程中包括所有对照试验操作过程中全程佩戴手套

8.PCR反应：设置如下反应循环，或根据taq酶说明书调整。

注意：根据不同taq酶说明书所描述的酶活化要求自行调整热启动时间。

9.琼脂糖凝胶电泳分析：配制1.3%TAE-琼脂糖凝胶，10μl扩增产物加2μlloadingbuffer混匀后10V/cm电泳。

10.分析结果。

三、结果示例分析

1.内对照（bp）：理想状态下，所有包含内对照DNA的样本均应在bp处出现扩增条带。而被支原体严重污染的细胞样本有可能不出现bp大小的扩增条带，这种情况下支原体DNA抑制了浓度相对低得多的内对照DNA的扩增，此时，检测结果应为支原体阳性。如果未出现任何条带，则既有可能taq酶活性受到了不明抑制剂影响，通过添加BSA或者重复试验。若重复试验之后仍然未出现bp大小条带，则从样本准备开始的整个检测过程都需重复一次。

2.支原体特异性扩增（-bp）：支原体阳性样本在-bp大小处出现条带，对于Acholeplasmalaidlawii支原体污染来说，当DSMZ的内对照得以扩增时，可能在bp大小与支原体特异性扩增条带之间出现第三条条带。这是由较长的单链内对照DNA和较短的单链野生型支原体的DNA互补序列交叉杂交所形成。

3.试剂污染：若试剂受到支原体特异性DNA污染，将能从阴性对照中反应出来。

4.其他情况：当细胞经抗支原体处理之后，若检测到阳性结果，可能是由于培养液中残留的支原体DNA或者仍然含有极少量支原体所导致。所以，特异性的支原体检测应在细胞无抗生素处理2-3周时进行，或者经常检测以确定支原体污染的有无或增减。

图2.采用混合引物PCR分析细胞系中的支原体污染。

阳性样本在bp大小左右处出现扩增条带，扩增产物大小的波动反应不同的支原体种类。每个样本有两个反应体系，一个是仅含有样本DNA的（靠左），另一个是含有待检样本DNA和内对照DNA的（靠右）。样本A/C/E支原体阳性，B支原体阴性。D无法判断，因为内对照未能扩增，并且未见支原体特异性扩增产物。样本C经抗生素处理2周的样本，显示了弱的但是可见的条带，抗生素处理4周后变为阴性。

四、辨别支原体种类

　　该PCR产物可以通过限制性长度多态性分析区别几种最常见的支原体污染种类。

　　在通过PCR来检测支原体污染种类时，需重复配制50μl仅含阳性样本DNA的PCR反应。反应结束后取8μl扩增产物，加入1μl10x酶切buffer和1μl限制性内切酶。通过下图判别支原体污染种类。这一分析只能辨别大多数（98%）细胞支原体污染中最常见的种类，并不适合所有支原体种类的辨别。

图3：鉴别支原体污染的流程图。

参考文献：

UphoffCC,DrexlerHG.Detectionofmycoplasmacontaminations.MethodsMolBiol.;:1-13.

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